七氟醚吸入對急性肺損傷大鼠肺組織HO-1表達的影響及機制初探.pdf

1、急性肺損傷（acutelunginjury，ALI）是臨床常見的難治性并發(fā)癥之一，是由嚴(yán)重感染、各種休克、創(chuàng)傷及外科手術(shù)等多種病因所致的肺實質(zhì)彌漫性損傷，是現(xiàn)代危重病醫(yī)學(xué)的一大難題，其預(yù)后差，若不能得到及時有效的治療，往往會發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合癥（ARDS），嚴(yán)重危及患者生命，并耗費大量的醫(yī)療資源。 目前對于ALI，臨床上除了在積極去除病因和控制原發(fā)病的基礎(chǔ)上之外，主要依賴于支持性治療。呼吸支持治療已經(jīng)得到廣泛公認，而藥物治療

2、的研究也取得了很多新的進展，其中吸入麻醉藥在近幾年來已成為一個研究熱點。七氟醚由于其具有對氣道無刺激性、血中溶解度低、麻醉誘導(dǎo)及蘇醒快速平順的藥理特點，已是臨床常用的吸入麻醉藥之一。 作為機體重要的內(nèi)源性保護蛋白血紅素氧合酶-1（HO-1）及其催化產(chǎn)物參與多種疾病的病理過程，HO-1活性或基因表達上調(diào)進而通過抗氧化、抗炎、抗凋亡等多重機制發(fā)揮組織器官保護作用，而抑制HO-1的表達則加重組織器官的損害。我們設(shè)計了本實驗，通過內(nèi)毒素

3、急性肺損傷大鼠模型，探討應(yīng)用七氟醚后處理對急性肺損傷的作用以期明確七氟醚治療ALI的分子生物學(xué)機制，為臨床治療性應(yīng)用提供理論依據(jù)。 目的： 建立內(nèi)毒素性ALI大鼠模型，研究大鼠急性肺損傷時，不同濃度七氟醚吸入后處理對肺組織形態(tài)學(xué)、氧合以及肺組織氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)的影響，明確七氟醚具有保護效應(yīng)的適宜吸入濃度；研究HO-1在七氟醚后處理內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷中的變化及其意義，初步探討HO-1發(fā)揮保護作用的調(diào)控機制。

4、 方法： 1.選取健康雄性SD大鼠，依文獻復(fù)制內(nèi)毒素性ALI大鼠模型：20％烏拉坦1g/kg腹腔注射麻醉后，氣管切開，插入導(dǎo)管行機械通氣，股靜脈緩慢注射LPS5mg/kg，對照組注入等量生理鹽水，各組于注射后6h行動脈血氣分析，放血處死大鼠，取肺組織行組織病理學(xué)檢查，判斷模型是否成功。 2.48只健康雄性SD大鼠行氣管切開機械通氣，隨機分為6組：生理鹽水對照組（A組）股靜脈注射1ml/kg生理鹽水后持續(xù)機械通氣6h；單純

5、1.5MAC七氟醚組（B組）股靜脈注射1ml/kg生理鹽水2h后吸入1.5MAC七氟醚并維持機械通氣4h；C、D、E、F四組分別股靜脈注射LPS5mg/kg制作ALI模型。C、D、E三組在注射LPS2h后分別吸入1.5MAC、1.0MAC、0.5MAC七氟醚并維持機械通氣4h；F組注射LPS后維持機械通氣6h。分別記錄并監(jiān)測注射LPS或生理鹽水前即刻（T0）、2h后（T1）、6h后（T2）三個時間點MAP、動脈血氣。6組大鼠皆于注射LP

6、S或生理鹽水6h后取肺組織檢測肺組織勻漿SOD、MPO活性和MDA含量；HE染色行肺組織病理學(xué)檢查；免疫印跡法檢測肺組織ICAM-1、CINC-1蛋白的表達，RT-PCR法檢測CINC-1、ICAM-1mRNA的表達。 3.48只健康雄性SD大鼠行氣管切開機械通氣，隨機分為6組：A、C、D、F組分別提前10min股靜脈注入生理鹽水1ml/kg；生理鹽水對照組（A組）股靜脈注射1ml/kg生理鹽水后持續(xù)機械通氣6h；ZnPP預(yù)處理

7、組（B組）提前10min股靜脈注入ZnPP（10mg/kg，10g·L-1），余同A組；單純1.0MAC七氟醚吸入組（C組）股靜脈注射1ml/kg生理鹽水2h后吸入1.0MAC七氟醚并維持機械通氣4h；LPS+1.OMAC七氟醚后處理組（D組）股靜脈注射LPS5mg/kg2h后吸入1.0MAC七氟醚4h；ZnPP預(yù)處理+LPS+1.0MAC七氟醚后處理組（E組）提前10min股靜脈注入ZnPP（10mg/kg，10g·L-1），余同D組

8、；LPS組（F組）股靜脈注射LPS5mg/kg后維持機械通氣6h。6組大鼠皆于注射LPS或第二次注射生理鹽水6h后取肺組織檢測肺組織勻漿SOD、MPO活性和MDA含量；HE染色行肺組織病理學(xué)檢查；Westernblotting法檢測肺組織ICAM-1、CINC-1、HO-1蛋白的表達，RT-PCR法檢測CINC-1、ICAM-1、HO-1mRNA的表達。 4.48只健康雄性SD大鼠行氣管切開機械通氣，隨機分為6組：除B、E兩組以

9、PI3K拮抗劑LY294002（1.5mg/kg，1.5g·L-1）代替ZnPP預(yù)處理外，其余實驗步驟以及A、C、D、F組的實驗步驟均同第三部分。6組大鼠取肺組織和檢測指標(biāo)除另Westernblotting法檢測PI3K、磷酸化PI3K（iPI3K）、Akt、磷酸化Akt（iAkt）蛋白表達外，余同第三部分。 結(jié)果： 1.LPS5mg/kg股靜脈注射后2h、6h，與基礎(chǔ)值和生理鹽水對照組比較MAP、PaO2以及氧合指數(shù)明

10、顯下降（p<0.05）；6h肺組織切片病理形態(tài)學(xué)改變符合ALI，證明ALI模型復(fù)制成功。 2.ALI大鼠肺組織SOD活性明顯下降，MDA含量、MPO活性以及ICAM-1、CINC-1mRNA及其蛋白表達明顯增高，與鹽水對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；0.5MAC、1.0MAC、1.5MAC七氟醚吸入4h后處理，肺組織病理損害減輕，病理形態(tài)學(xué)積分下降，SOD活性上升，MDA含量、MPO活性以及ICAM-1、CINC-

11、1mRNA及其蛋白表達降低，以1.0MAC和1.5MAC七氟醚吸入組更明顯，與未吸入七氟醚的ALI組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；1.5MAC七氟醚吸入組在T2時點MAP下降比1.0MAC七氟醚吸入組更明顯（p<0.05），但在病理形態(tài)學(xué)積分、SOD、MDA、MPO、ICAM-1、CINC-1mRNA及其蛋白表達等指標(biāo)方面沒有明顯差異（p>0.05）；單純1.5MAC七氟醚吸入除MAP下降外，與鹽水對照組比較上述指標(biāo)沒有明顯差

12、異。 3.與鹽水對照組比較，ALI組肺組織HO-1mRNA及其蛋白表達上調(diào)（p<0.05）；與ALI組比較，1.0MAC七氟醚吸入后處理組HO-1mRNA及其蛋白表達進一步上調(diào)（p<0.05）；HO-1拮抗劑ZnPP預(yù)處理后七氟醚吸入HO-1mRNA及其蛋白表達下調(diào)，肺組織病理損害加重，病理形態(tài)學(xué)積分增加，SOD活性明顯下降，MDA含量、MPO活性以及ICAM-1、CINC-1mRNA及其蛋白表達明顯增高，與1.0MAC七氟醚吸

13、入后處理組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；單純七氟醚吸入組和單純ZnPP處理組肺組織HO-1mRNA及其蛋白表達與鹽水對照組比較無差異（p>0.05）。 4.與鹽水對照組比較，ALI組肺組織PI3K、Akt無差異（p>0.05），但iPI3K、iAkt蛋白表達上調(diào)（p<0.05）；1.0MAC七氟醚吸入后處理后iPI3K、iAkt蛋白表達進一步上調(diào)（p<0.05）；PI3K拮抗劑LY294002預(yù)處理的七氟醚吸入后處理組

14、與未用拮抗劑的七氟醚吸入后處理組比較，iPI3K、iAkt蛋白、HO-1mRNA及其蛋白表達下調(diào)（p<0.05），但在肺組織病理形態(tài)學(xué)積分、SOD、MDA、MPO以及ICAM-1、CINC-1mRNA及其蛋白表達指標(biāo)方面，無明顯差異（p>0.05）。 結(jié)論： 1.5mg/kgLPS股靜脈注射可誘導(dǎo)SD大鼠產(chǎn)生ALI，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是ALI的發(fā)病機制之一； 2.不同濃度七氟醚吸入后處理能減輕LPS所致ALI氧化

15、應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，其中以1.0MAC七氟醚吸入后處理為較適宜的藥物濃度； 3.對已發(fā)生的LPS誘導(dǎo)ALI七氟醚后處理可通過上調(diào)HO-1mRNA及其蛋白表達起保護作用； 4.內(nèi)毒素性ALI可引起肺組織PI3K/Akt磷酸化水平提高，同時HO-1mRNA及其蛋白表達上調(diào)： 5.PI3K/Akt細胞信號傳導(dǎo)通路部分參與了七氟醚對HO-1mRNA及其蛋白表達的調(diào)控。 本實驗課題的創(chuàng)新點和不足之處1.創(chuàng)新點（1）目前

16、臨床上導(dǎo)致急性肺損傷最常見原因是膿毒癥，本實驗采用LPS誘導(dǎo)，2h后再進行藥物處理，利用這種最接近臨床實際且已經(jīng)發(fā)生ALI的大鼠模型作為研究對象，更具有現(xiàn)實指導(dǎo)意義。 （2）七氟醚作為一種新型麻醉藥，其非麻醉方面的器官保護作用已倍受關(guān)注，七氟醚預(yù)處理在缺血再灌注損傷方面的保護作用已得到證實；而七氟醚的后處理方式以及其對炎癥反應(yīng)所致肺損傷的作用都鮮有研究，本實驗證實了七氟醚吸入對脂多糖所致的急性肺損傷具有治療作用。 （3）

17、熟應(yīng)激、缺血預(yù)處理及基因轉(zhuǎn)染等研究都是在誘發(fā)ALI前采取各種方法誘導(dǎo)肺組織內(nèi)源性保護蛋白的表達，如HO-1的表達，因此其保護作用屬于預(yù)防性的。如果在ALI發(fā)生之后誘導(dǎo)或增加HO-1的表達，是否具有保護作用目前尚不明確。本實驗研究證實在ALI發(fā)生之后誘導(dǎo)或增加HO-1的表達對肺組織亦具保護作用。 （4）本實驗通過一條比較完整的信號通路鏈觀察了七氟醚對LPS誘導(dǎo)ALI的作用，并首次探討了PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對肺組織HO-1的