蛻皮甾酮對急性肺損傷大鼠肺組織中TNF-αmRAN及SP-A表達的影響.pdf

1、背景：急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是指機體遭受嚴重創(chuàng)傷、休克、嚴重感染等打擊后，出現(xiàn)肺血管內(nèi)皮細胞及肺泡上皮細胞廣泛損傷為病理特征的一種失控炎癥反應;是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的早期階段，臨床上表現(xiàn)為進行性肺部彌漫性滲出致呼吸困難及難以糾正的低氧血癥。目前ALI/ARDS發(fā)病機制復雜，尚未完全闡明，但經(jīng)過大量基礎研究表明氧化應激反應、炎性反應、內(nèi)皮細胞功能紊亂等改變均參與疾病發(fā)展，其中炎癥與抗炎癥反應之

2、間平衡與失衡在發(fā)病過程中起重要作用。目前，普遍認為ALI發(fā)病機制是在致病因子作用下激活中性粒細胞等多種炎性細胞，并釋放大量炎性介質(zhì)造成機體的損傷，同時這些炎性因子能作用其他炎性細胞來釋放更多的炎性介質(zhì)或細胞因子，使機體損害信號進一步放大，形成炎癥瀑布效應，引起的過度或失控性的全身性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。在臨床上，急性肺損傷的主要原因是細菌感染后釋放內(nèi)毒

3、素引起的，致病主要成分是細菌細胞壁外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。LPS與相應受體結(jié)合后，啟動細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，促進各種炎性細胞因子TNF-α等釋放。這些炎性細胞和炎癥介質(zhì)相互作用，造成肺泡細胞、內(nèi)皮細胞損傷，血管通透性增加，導致肺水腫，引起肺表面活性物質(zhì)分泌減少，肺泡上皮屏障破壞。所以，本實驗通過大鼠腹腔注射LPS復制ALI模型，并給予特定藥物治療，來觀察炎性介質(zhì)及抗炎物質(zhì)水平的動態(tài)變化。腫瘤壞死因子

4、α(Tumor Necrosis Factorα，TNF-α)在炎癥中是一具始動和關(guān)鍵性作用的促炎免疫分子，主要由激活的中性粒細胞、單核/巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等細胞分泌，是具有多種功能的多肽。目前已知TNF-α與相應受體結(jié)合后，刺激炎性細胞粘附并釋放氧自由基等大量炎性介質(zhì)來發(fā)揮細胞毒性作用;刺激單核巨噬細胞增加IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等炎性因子的產(chǎn)生，進一步加重組織損傷。因此，TNF-α是觀察ALI程度較好指標。表面活性蛋白

5、(Surfactant Protein，SP)是主要由肺泡Ⅱ型上皮細胞和細支氣管非纖毛上皮細胞分泌的一類特異性脂蛋白復合物。SP含量中最豐富且生物活性最強的蛋白是肺表面活性蛋白A（Surfactant ProtemA，SP-A）。研究表明，它能維持肺泡的正常結(jié)構(gòu)和功能;調(diào)節(jié)肺內(nèi)免疫和炎癥反應;參與調(diào)節(jié)肺表面活性物質(zhì)的合成、代謝;通過特異性與微生物和微粒子結(jié)合，增強吞噬細胞的吞噬和殺菌能力，并抑制多種細胞因子和炎癥介質(zhì)的合成與釋放。目前認

6、為，SP-A在ALI患者中存在內(nèi)源性代謝異常而減少，加重急性肺損傷。迄今，ALI/ARDS的藥物治療已成為臨床研究的一個熱點，但仍未找到切實可靠的治療性藥物，所以尋找其保護性藥物十分必要。蛻皮甾酮(Ecdysterone，EDS)是一種廣泛存在自然界的甾體化合物，屬于昆蟲生長代謝調(diào)節(jié)激素，最早為昆蟲學家研究?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)EDS在植物界也廣泛存在且同樣在高等動物表現(xiàn)出較強的生理活性:能促進核酸及蛋白質(zhì)的合成、抗氧化、促進缺血區(qū)血管的生成和側(cè)支循

7、環(huán)的建立，還能有效促進傷口愈合等。近年來研究表明EDS還能改善肺組織水腫、降低肺血管通透性等作用，提示對ALI可能具有一定治療作用。為了進一步探討EDS對ALI治療作用機理，我們通過脂多糖誘導ALI大鼠模型，觀察EDS對ALI大鼠的肺組織中炎性介質(zhì)TNF-α及SP-A的水平變化，以闡明EDS對ALI的治療作用效果及可能的機制。
　　 目的：觀察不同劑量EDS對ALI大鼠肺組織中TNF-α mRNA及SP-A的表達的影響及其相關(guān)性

8、;探討蛻皮甾酮(EDS)對脂多糖(LPS)誘導大鼠急性肺損傷(ALI)的保護機理。
　　 方法：⑴實驗動物模型制作與分組方法:通過Wister大鼠腹腔注射LPS建立急性肺損傷模型。120只健康SPF級成年雄性Wister大鼠，體重170-220克，隨機分為模型組(24只，L組)、空白對照組(24只，N組)、治療組（即不同劑量蛻皮甾酮組，T組）[分3個亞組:LPS+EDS20mg/kg組(T1組，24只)、LPS+EDS30mg/

9、kg組(T2組，24只)、LPS+EDS40mg/kg組(T3組，24只)]，各組根據(jù)注射脂多糖后觀察時間不同再分為2h、4h、24h共3個亞組，每組8只。模型組和治療大鼠均經(jīng)腹腔注射脂多糖8 mg/kg復制急性肺損傷模型，對照組腹腔注射等體積生理鹽水。蛻皮甾酮不同劑量治療組在建模1h后給予相應劑量的蛻皮甾酮溶液尾靜脈注射;對照組及模型組給予相應等體積生理鹽水。⑵標本采集檢測方法:分別于相應時間用3％戊巴比妥鈉(30m/kg)腹腔麻醉各

10、組后，腹主動脈放血處死動物?？焖偌糸_胸腔，取出雙側(cè)肺臟。取各組大鼠右肺下葉HE染色觀察病理改變，并根據(jù)病理學改變進行相應評分;取右上肺葉，計算各組肺濕重與肺干重比值（W/D）;并使用實時熒光定量PCR即(Real-timePCR，RT-PCR)法檢測左肺組織勻漿TNF-α mRNA的表達;使用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定左肺組織勻漿中TNF-α;采用Western Blot方法檢測SP-A的表達水平。
　　 結(jié)

11、果：①一般狀態(tài)觀察:N組的大鼠呼吸平穩(wěn)，未見紫紺，活動基本正常，反應靈敏;L組的大鼠在注射LPS后呼吸明顯加快，活動不活躍，抓取時無力逃避，以4h最為明顯并伴有紫紺;T組的大鼠呼吸急促程度較LPS組有所減輕，個別大鼠出現(xiàn)輕微紫紺，但較LPS組活潑，抓取時能夠逃避。其中2h時，T組的狀況相似，但在4h、24h時T3組較T1、T2組大鼠的狀況較好。②光鏡下觀察:200倍光鏡下觀察大鼠右下肺組織HE染色結(jié)果顯示:N組大鼠肺組織的結(jié)構(gòu)物完整，肺

12、泡間隔無水腫，肺泡腔清晰，肺泡間質(zhì)無炎性細胞浸潤;L組肺泡壁破壞，腔內(nèi)出血，肺間質(zhì)充血水腫，有大量炎性細胞浸潤;提示肺損傷模型成功。不同劑量T組的肺組織中相對于L組上述改變均有所減輕，程度隨劑量增加而減輕。肺損傷的病理學評分依據(jù)肺泡和間質(zhì)炎癥及出血、肺水腫、肺不張和透明膜形成;經(jīng)評分后進行統(tǒng)計學分析，各組間病理改變程度為L＞T1＞T2＞T3＞N;時間趨勢為:各組肺損傷程度評分在時間上以4h為重，24h次之，2h較輕。③肺干重/濕重(W/

13、D):與N組相比，L組及T組在2h，4h，24h各時間點W/D顯著升高(P＜0.05)，其中4h為高峰，24h次之，2h最低。與L組相比，T組各亞組在4h，24h時間點W/D均顯著降低(P＜0.05)，但在2h里，L組與T1、T2差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而T3明顯降低(P＜0.05)。同一組內(nèi)在不同時間上W/D的趨勢為:4h＞24h＞2h。④肺組織中TNF-僅含量:N組TNF-α在各時相點表達均非常微弱，且相互之間無明顯差別。

14、其余各組與N組相比，表達均明顯增強(P＜0.05)。與LPS組比較，T組各亞組間在2h、4h、24h均可顯著降低肺組織TNF-α的含量(P＜0.05)。亞組之間比較:T3組在4h、24h時間點TNF-α的表達呈現(xiàn)T3＜T2、T1(P＜0.05)，但在2h時與T2無明顯差異;T2在2h、4h時間點TNF-α的表達顯著低于T1(P＜0.05)，兩者在24 h無明顯差異。在時間表達上，L組及各T亞組的組內(nèi)在三個時間點的肺組織TNF-α的含量兩

15、兩相比均有顯著差異(P＜0.05)，呈現(xiàn)4h＞2h＞24h(P＜0.05)。⑤肺組織中TNF-α mRNA含量:實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示:N組TNF-α mRNA在各時相點的表達均非常微弱，且相互之間無明顯差別。其余各組與N組相比，表達均明顯增強(P＜0.05)。與LPS組比較，T組在不同時間點均可顯著降低肺組織TNF-α mRNA的表達(P＜0.05)。T組亞組之間在2h、4h、24 h時間點TNF-α mRNA的表達均呈

16、現(xiàn)T3＜T2＜T1(P＜0.05)。時間表達趨勢為4小時最高，2小時次之，24小時最低，即4h＞2h＞24h(P＜0.05)。⑥肺組織中SP-A含量:在2h、4h、24h里，N組大鼠肺組織中SP-A表達無明顯差異，但均明顯高于比T組和L組(P＜0.05);T組各亞組之間在不同時間點的SP-A表達都高于L組，且有顯著性差異(P＜0.05);T組亞組之間在24h時間點的肺組織SP-A表達隨劑量增加而逐漸上升，即T3＞T2＞T1(P＜0.05

17、)，在2h時，呈現(xiàn)T3＞T2、T1(P＜0.05)，但T2、T1在此時間點相比無顯著差異(P＞0.05)。在4h時，呈現(xiàn)T3、T2＞T1(P＜0.05)，但T2、T3在此時間點相比無顯著差異(P＞0.05)。時間表達趨勢為4小時最低，24小時次之，2小時最高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：⑴通過腹腔注射LPS可以成功復制ALI大鼠模型。⑵LPS注射后導致大鼠肺組織水腫;光鏡下肺損傷嚴重;促炎細胞因子TNF-α mRNA表達增強;