錳干擾谷氨酸代謝和NMDA受體表達及MK-801對其防護作用的研究.pdf

1、目的：
　　 錳(Manganese,Mn)作為機體必需的微量元素之一,在體內(nèi)可以參與構成許多酶的活性基團或輔助因子,同時又是某些酶的激活劑,參與許多生物化學反應,但是過量的錳進入體內(nèi)則會引起錳中毒。進入體內(nèi)的錳可穿透血-腦屏障,蓄積在腦組織內(nèi),早期主要表現(xiàn)為神經(jīng)行為功能的改變,長期過量接觸錳主要表現(xiàn)為錐體外系損傷,出現(xiàn)類似帕金森氏綜合征的癥狀。因此,關于錳的神經(jīng)毒性研究備受廣大學者的關注。對錳神經(jīng)毒作用機理的研究至今尚未完全闡

2、明,錳的神經(jīng)毒作用涉及諸多方面:過量的錳可增加神經(jīng)細胞的代謝,破壞線粒體,提高溶酶體活性,發(fā)生自消化作用,引起神經(jīng)細胞退變及損傷,還可激活細胞色素氧化酶P-450活性而產(chǎn)生自由基。近年來研究表明,錳可干擾腦內(nèi)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的代謝而產(chǎn)生間接興奮性神經(jīng)毒作用。作為興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)受體之一的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)具有獨特的結構功能特點,它既是配體門控受體

3、,又是電壓依賴性門控受體,因而在神經(jīng)生理、病理和毒理學研究中NMDA受體也受到了特別關注。MK-801是一種強有力NMDA受體非競爭性拮抗劑,易通過血腦屏障,可作用于NMDA受體通道內(nèi)部的苯環(huán)哌啶位點進行別構調(diào)節(jié),能有效阻滯谷氨酸與突觸后膜受體結合,阻斷NMDA受體偶聯(lián)的Ca2+通道激活,使Ca2+內(nèi)流減少,從而使NMDA受體作用減弱。為了進一步了解錳對興奮性神經(jīng)遞質(zhì)代謝的影響與神經(jīng)細胞損傷的關系,以及MK-801對錳神經(jīng)毒性的防護作用

4、。我們將從體內(nèi)和體外實驗兩方面研究如下問題:①錳對谷氨酸代謝的影響,②錳對NR1、NR2A和NR2B亞單位表達的影響,③錳對原代培養(yǎng)神經(jīng)元的毒性作用,④MK-801對錳致神經(jīng)損傷的防護作用。這將對我們進一步了解錳神經(jīng)毒性的具體機制有十分重要的意義,將為錳致神經(jīng)細胞損傷的發(fā)病機理和防治提供重要理論和實驗依據(jù)。
　　 實驗方法
　　 一、體內(nèi)動物實驗
　　 (一)實驗動物與分組
　　 由中國醫(yī)科大學實驗動物中

5、心提供的實驗用Wistar大鼠100只,體重170～190 g,雌雄各半。正式實驗前飼養(yǎng)7 d,然后按體重隨機分成5組,每組20只。第1組為對照組,腹腔注射0.9％氯化鈉,第2-4組為錳染毒組,分別腹腔注射8,40,200 μmol/kg的氯化錳溶液,第5組為MK-801預處理組,隔日皮下注射0.3 μmol/kg的MK-801溶液,2 h后腹腔注射200 μmol/kg的氯化錳溶液,注射容量均為5 ml/kg。每周注射5次,共4周。<

6、br>　　 (二)測定指標
　　 1、腦紋狀體錳含量的測定
　　 染毒4周后,每組處死8只大鼠,取出一定量的紋狀體組織,用原子吸收分光光度火焰法測定Mn含量。
　　 2、腦紋狀體Glu和Gln含量的測定
　　 染毒4周后,每組處死6只大鼠,取出一定量的紋狀體組織,按南京建成試劑盒說明書操作,測定Glu和Gln含量。
　　 3、腦紋狀體PAG和GS活力的測定
　　 染毒4周后,每組處死6只

7、大鼠,取出一定量的紋狀體組織,分別按Curi和Renis描述的方法測定PAG和GS活力。
　　 4、腦紋狀體NMDA受體mRNA和蛋白表達的測定
　　 每組取4只大鼠紋狀體組織,分別用RT-PCR和Western blot方法檢測mRNA和蛋白的表達,按常規(guī)方法提取總RNA和總蛋白,檢測NR1,NR2A和NR2B的mRNA表達,用G3PDH作內(nèi)參；檢測NR1,NR2A和NR2B的蛋白表達,用β-actin作內(nèi)參,用凝膠成

8、像分析系統(tǒng)照相,測定各條帶的灰度值。
　　 5、細胞凋亡的測定
　　 每組4只大鼠取一定量紋狀體組織,制成單細胞懸液后,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率；每組2只大鼠用4％的多聚甲醛灌流固定,取出紋狀體進一步處理后,電鏡觀察神經(jīng)元細胞凋亡。
　　 二、體外神經(jīng)元細胞培養(yǎng)
　　 (一)神經(jīng)元培養(yǎng)
　　 取新生鼠腦,去腦膜后切碎,用胰蛋白酶消化后,將細胞懸液轉移到200目篩網(wǎng)中過濾,以含有10％馬血清的DM

9、EM培養(yǎng)基稀釋細胞懸液至1×106/1.5 ml,接種于經(jīng)多聚賴氨酸過夜處理的直徑為60mm的培養(yǎng)皿中,置于37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后,吸去DMEM培養(yǎng)基,換成無血清的Neurobasal培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。加入阿糖胞苷,抑制非神經(jīng)元的增值和生長。
　　 (二)神經(jīng)元的鑒定
　　 倒置顯微鏡觀察神經(jīng)元表面光滑,胞體大、飽滿,呈錐體形、星形、多角形或不規(guī)則形,突起清晰,均勻細長,2～5個不等,突起之間相互交織成網(wǎng),連結

10、緊密。用免疫細胞化學的方法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)。
　　 (三)測定指標
　　 1、細胞活力測定
　　 待細胞生長狀態(tài)最佳時加入含錳的培養(yǎng)液,錳處理濃度分別為0,12.5,25,50,100,200,400 μmol/L 7個組,MK-801預處理組,用10 μmol/L MK-801預處理30 min后,再用400 μmol/L氯化錳處理神經(jīng)元,分別培養(yǎng)6、12、24、48 h后,用MTT法測定細胞

11、活力。
　　 2、培養(yǎng)液中LDH活力的測定
　　 神經(jīng)元細胞用錳處理濃度分別為0,12.5,25,50,100,200,400 μmol/L7個組,MK-801預處理組,用10 μmol/L MK-801預處理30 min后,再用400 μmol/L氯化錳處理神經(jīng)元,分別培養(yǎng)6、12、24、48 h后,用比色法測定LDH活力。
　　 3、TUNEL法檢測細胞凋亡
　　 神經(jīng)元細胞用錳處理濃度分別為0,25

12、,100,400 μmol/L 4個組,MK-801預處理組,用10 μmol/L MK-801預處理30 min后,再用400 μmol/L氯化錳處理神經(jīng)元,培養(yǎng)12 h后,按原位細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行凋亡細胞染色,分析細胞凋亡率。
　　 4、神經(jīng)元細胞NMDA受體mRNA和蛋白表達的測定
　　 神經(jīng)元細胞用錳處理濃度分別為0,25,100,400 μmol/L 4個組,MK-801預處理組,用10 μmol/L

13、 MK-801預處理30 min后,再用400 μmol/L氯化錳處理神經(jīng)元,培養(yǎng)12 h后,分別用RT-PCR和Western blot方法檢測mRNA和蛋白的表達,按常規(guī)方法提取總RNA和總蛋白,檢測NR1,NR2A和NR2B的mRNA表達,用G3PDH作內(nèi)參；檢測NR1,NR2A和NR2B的蛋白表達,用β-actin作內(nèi)參,用凝膠成像分析系統(tǒng)照相,測定各條帶的灰度值。
　　 5、神經(jīng)元細胞Ca2+濃度的測定
　　

14、神經(jīng)元細胞用錳處理濃度分別為0,25,100,400 μmol/L4個組,MK-801預處理組,用10 μmol/L MK-801預處理30 min后,再用400 μmol/L氯化錳處理神經(jīng)元,培養(yǎng)12 h后,用雙波長熒光分光光度計檢測。
　　 6、神經(jīng)元Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力的測定
　　 神經(jīng)元細胞用錳處理濃度分別為0,25,100,400 μmol/L 4個組,MK-801預處理組,用

15、10 μmol/L MK-801預處理30 min后,再用400 μmol/L氯化錳處理神經(jīng)元,培養(yǎng)12 h后,提取膜蛋白用比色法測定。
　　 結論：
　　 1、通過對大鼠腹腔注射氯化錳溶液成功建立了錳中毒大鼠模型。研究發(fā)現(xiàn),錳可以在腦組織中聚積,損傷神經(jīng)細胞,使大鼠產(chǎn)生神經(jīng)毒性。
　　 2、通過體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn),錳可破壞鼠腦紋狀體內(nèi)“Glu-Gln循環(huán)通路”,使Glu含量升高,此機制與錳干擾Glu代謝相關酶有關

16、,錳可使PAG活力升高,GS活力下降。
　　 3、通過體內(nèi)動物實驗和體外神經(jīng)元細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),錳可以抑制NR1、NR2A和NR2B亞單位mRNA和蛋白的表達,并且NR2A亞單位對錳的抑制作用最敏感。
　　 4、利用體外神經(jīng)元培養(yǎng)技術發(fā)現(xiàn),錳對體外培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞具有明顯的毒性作用。
　　 5、錳可以干擾體外培養(yǎng)神經(jīng)元細胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)。
　　 6、由于MK-801能有效阻滯谷氨酸與突觸后膜受體結合,既可以阻