代謝型谷氨酸受體6在黑素細(xì)胞形態(tài)及黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用研究.pdf

1、目的:
　　探討代謝型谷氨酸受體6(metabotropic glutamate receptor6，mGluR6)對(duì)黑素細(xì)胞形態(tài)影響及其在黑素細(xì)胞-角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系中對(duì)黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.原代培養(yǎng)純化黑素細(xì)胞，合成慢病毒載體Lv-mGluR6-shRNA，對(duì)黑素細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并敲除mGluR6表達(dá)。
　　2.免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后mGlu

2、R6的表達(dá)情況。
　　3.掃描電鏡觀察Lv-mGluR6-shRNA轉(zhuǎn)染后黑素細(xì)胞的偽足及樹(shù)突形態(tài)變化。
　　4.建立體外黑素細(xì)胞與HaCat角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系。掃描電鏡觀察Lv-mGluR6-shRNA轉(zhuǎn)染后共培養(yǎng)體系中絲狀偽足連接的變化;NaOH法測(cè)定共培養(yǎng)體系中角質(zhì)形成細(xì)胞中的黑素含量;運(yùn)用免疫熒光雙染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)效率。
　　5.免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察Lv-mGluR6-shR

3、NA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞骨架蛋白β-tublin的分布變化和共培養(yǎng)體系下黑素細(xì)胞在角質(zhì)形成細(xì)胞中分布含量的區(qū)別。
　　結(jié)果:
　　1.掃描電鏡發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染后，樹(shù)突變短，二、三級(jí)樹(shù)突數(shù)量減少，細(xì)胞表面?zhèn)巫銛?shù)目明顯減少。
　　2.黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，兩細(xì)胞間以絲狀偽足相連，轉(zhuǎn)染后的共培養(yǎng)體系中，相連接的絲狀偽足數(shù)量明顯減少。
　　3.共培養(yǎng)48小時(shí)后，NaOH法測(cè)定轉(zhuǎn)染組角質(zhì)形成細(xì)胞中黑素含量明顯

4、少于對(duì)照組。
　　4.使用NKI/beteb抗體標(biāo)記黑素小體、廣譜細(xì)胞角蛋白抗體標(biāo)記角質(zhì)形成細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察角質(zhì)形成細(xì)胞中分布黑素小體。與對(duì)照組相比，慢病毒轉(zhuǎn)染后角質(zhì)形成細(xì)胞中的黑素小體數(shù)目明顯減少;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示黑素小體在角質(zhì)形成細(xì)胞中的含量隨時(shí)間遞增，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)運(yùn)效率明顯下降。
　　5.激光共聚焦顯微鏡觀察β-tublin抗體標(biāo)記的細(xì)胞骨架蛋白在轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組有明顯差異;轉(zhuǎn)染組骨架蛋白呈點(diǎn)狀分布

5、，不呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相連接;對(duì)照組骨架蛋白成管束狀分布均勻。
　　結(jié)論:
　　1.mGluR6的表達(dá)與黑素細(xì)胞骨架蛋白分布及黑素細(xì)胞形態(tài)密切相關(guān)。
　　2.mGluR6的表達(dá)與共培養(yǎng)體系中絲狀偽足的形成有關(guān)。
　　3.mGluR6的表達(dá)影響共培養(yǎng)體系中黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　4.mGluR6的表達(dá)影響黑素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)，其可能機(jī)制為:(1)通過(guò)改變黑素細(xì)胞骨架蛋白分布和形態(tài)影響黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)。(2)通過(guò)改變共培養(yǎng)體系中絲