代謝型谷氨酸受體5-脂多糖作用小膠質細胞的全新靶點初步研究.pdf

1、正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)因血腦屏障的存在使免疫系統(tǒng)的成分不能進入，被認為是免疫特免區(qū)。然而，越來越多的證據(jù)顯示，中樞與免疫系統(tǒng)存在著相互作用。神經(jīng)通路參與了細胞與體液免疫反應的調控，而免疫系統(tǒng)也主要通過細胞因子來影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內有免疫受體的分布，而免疫系統(tǒng)也有神經(jīng)受體的表達，它們共用一套相同的信號分子（神經(jīng)遞質，神經(jīng)肽，細胞因子等）。長久以來，神經(jīng)-免疫間相互作用的研究都局限于其信號分子與受體間的作用，在神經(jīng)細胞上往往同時

2、有免疫受體的表達，而在免疫細胞，特別是小膠質細胞上同樣也可見到神經(jīng)受體的表達，那么在這兩類受體之間除通過神經(jīng)遞質或免疫因子產生相互作用外，是否在受體蛋白之間存在直接的相互作用，目前尚未見相關報道。為此，本研究，擬以腦小膠質細胞為切入點，就小膠質細胞免疫受體與神經(jīng)受體是否存在直接的蛋白作用進行探討，期望所獲結果能有助于我們更好地理解神經(jīng)系統(tǒng)-免疫系統(tǒng)之間的聯(lián)系，并為臨床相關疾病的防治提供有益的理論基礎。
　　小膠質細胞廣泛分布于中樞

3、神經(jīng)系統(tǒng)內，參與腦內的固有免疫反應，構成中樞神經(jīng)系統(tǒng)抵御病原體入侵的第一防線，被認為是正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最有代表性的免疫細胞。小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損傷后最早發(fā)生反應的細胞類型。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種病理狀態(tài)如創(chuàng)傷，中風，炎癥反應和神經(jīng)退行性疾病等，均可激活小膠質細胞，啟動固有免疫反應，產生多種細胞因子及炎癥趨化因子，進而導致各種白細胞穿過血腦屏障到達炎癥反應區(qū)域。神經(jīng)元-小膠質細胞間的相互作用在控制小膠質細胞的功能及其激活方面起到了重

4、要的作用。小膠質細胞上表達各種神經(jīng)遞質受體來，感受神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質，調控小膠質細胞的活性，并進一步對神經(jīng)元上的相關受體作用從而影響神經(jīng)元的功能。小膠質細胞在神經(jīng)-免疫相互作用中起到了至關重要的作用。
　　小膠質細胞上有多種神經(jīng)遞質受體(D2DR，NMDAR1，mGluR5等)和天然免疫受體(TLR4)的表達，弄清這些受體在炎癥反應時的相互作用，對炎癥機制的了解會起到很大的推動作用。本實驗以LPS刺激小膠質細胞為炎癥模型，使用了

5、三種小膠質細胞，1 TLR4正常的小膠質細胞株N9;2 TLR4缺陷的小膠質細胞株EOC20;3 TLR4缺失的原代小膠質細胞。研究了上述免疫受體及神經(jīng)遞質受體在炎癥反應時的相互作用關系。
　　實驗從研究炎癥狀態(tài)時小膠質細胞上天然免疫受體(TLR4)與神經(jīng)遞質受體(D2DR，NMDAR1)間相互作用入手，通過免疫共沉淀，熒光共定位及熒光共振能量轉移(FRET)技術證實了免疫受體TR4與神經(jīng)遞質受體NMDAR1受體間存在蛋白質相互作

6、用后，進一步的功能實驗發(fā)現(xiàn)LPS刺激能引發(fā)小膠質細胞的鈣振蕩現(xiàn)象，這種鈣振蕩與小膠質細胞上表達的mGluR5受體有關。后續(xù)實驗圍繞mGluR5受體，利用免疫共沉淀，F(xiàn)RET，免疫熒光共定位，NF-κB報告基因及ELISA等相關技術，研究了mGluR5受體在LPS刺激小膠質細胞時的作用及其與LPS，NMDAR1，TLR4間的相互關系，得到結果如下:
　　主要結果和結論:
　　1、N9，EOC20小膠質細胞株上有多巴胺D2受體(

7、D2DR)的表達，LPS刺激后其表達量增高，但免疫共沉淀實驗未檢測到TLR4/D2DR受體間的蛋白質相互作用;
　　2、N9，EOC20小膠質細胞株上有免疫受體TLR4受體的表達，N9，EOC20細胞株及TLR4缺失的原代小膠質細胞上均有谷氨酸受體mGluR5及NMDAR1受體的表達，小膠質細胞上的免疫與神經(jīng)受體的共表達為神經(jīng)與免疫系統(tǒng)間的聯(lián)系奠定了物質基礎;
　　3、LPS刺激N9，EOC20小膠質細胞株時，LPS能與mG

8、luR5受體直接結合，提示LPS在作用于小膠質細胞時存在TLR4以外的信號通路;
　　4、LPS刺激N9，EOC20細胞株及TLR4缺失的原代小膠質細胞均能引發(fā)熒光鈣振蕩;這種振蕩依賴于細胞內的游離鈣離子，并能被mGluR5受體拮抗劑所拮抗。結果提示LPS刺激通過小膠質細胞時通過直接作用于mGluR5受體，引發(fā)小膠質細胞的熒光鈣振蕩;
　　5、LPS刺激N9，EOC20細胞株及TLR4缺失的原代小膠質細胞后，能夠引發(fā)NMDA

9、R1受體的Ser896位點的磷酸化，這種磷酸化能被mGluR5受體拮抗劑所拮抗。結果提示LPS刺激小膠質細胞，可直接作用于mGluR5受體引發(fā)了NMDAR1受體的磷酸化過程;
　　6、LPS刺激N9，EOC20小膠質細胞株，能引發(fā)TLR4/NMDAR1間的蛋白質相互作用，這種相互作用能被mGluR5受體拮抗劑所拮抗;
　　7、LPS刺激N9，EOC20小膠質細胞株時，通過作用于mGluR5受體，能增強NF-κB的活性。提示L

10、PS作用于小膠質細胞時，存在TLR4以外的活化NF-κB的途徑;
　　8、對mGluR5受體的激活，能抑制LPS刺激N9細胞導致的TNF-α分泌增高。提示mGluR5受體參與了抗炎反應，可能成為調節(jié)炎癥反應的新的靶點。
　　綜上所述，我們的研究證實了在小膠質細胞上，LPS除了經(jīng)典的TLR4信號通路以外，還存在mGluR5受體這個新的作用靶點，LPS通過這個靶點，活化了NF-κB，通過某種機制，降低了TNF-α炎性介質的分泌，