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1、目的:L-谷氨酸是一類(lèi)興奮性氨基酸,是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)。成骨細(xì)胞上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有谷氨酸受體的存在。谷氨酸受體有很多種,其中N甲基D天冬氨酸(NMDA)受體是研究最為廣泛的一種受體。其開(kāi)放后會(huì)引起鈣離子內(nèi)流。本研究探討NMDA受體激活后成骨細(xì)胞增殖和分化情況以及其可能參與其中的和鈣離子有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路變化情況。鑒于NMDA和機(jī)械拉力都可以促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子的內(nèi)流。因此,我們假設(shè)NMDA可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械拉力的反應(yīng)。在有神
2、經(jīng)遞質(zhì)NMDA的條件下,研究機(jī)械應(yīng)力對(duì)分化的成骨細(xì)胞的作用,以及可能參與其中的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路。 方法:取大鼠原代成骨細(xì)胞。ELISA方法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)以及骨鈣素變化。茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色。用不同濃度的NMDA(NMDA受體激動(dòng)劑)0.02-0.5 mM以及MK801(NMDA受體阻斷劑)0.05-0.2 mM處理成骨細(xì)胞,觀察成骨細(xì)胞增殖和分化情況。Western blot方法檢測(cè)MAPK信號(hào)通路(ERK1/2,p
3、38以及JNK通路)。同時(shí)觀察PKA,PKC,PI3K通路變化情況?;蛐酒夹g(shù)觀察成骨細(xì)胞NMDA受體激活后下游基因改變情況。在有或無(wú)NMDA的條件下,給予大鼠原代成骨細(xì)胞反復(fù)拉力刺激48小時(shí)測(cè)定成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物,在有或無(wú)NMDA條件下,給予成骨細(xì)胞拉力刺激,觀察MAPK信號(hào)通路變化情況。 結(jié)果:NMDA可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,促進(jìn)ALP以及骨鈣素的表達(dá),呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性(p<0.001)。NMDA也可以促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)
4、生成,這一效應(yīng)被MK801所抑制。NMDA受體激活后可以激活ERK1/2,PKA,PKC,PI3K.信號(hào)通路。NFκB,Ddit3主要是NMDA影響成骨細(xì)胞的下游基因。經(jīng)0.5 mM NMDA預(yù)處理的成骨細(xì)胞,給予拉力之后,成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物明顯增多,而MK801(NMDA受體阻斷劑)可以阻斷這一效應(yīng)。為了進(jìn)一步研究該現(xiàn)象可能存在的機(jī)制,無(wú)NMDA存在時(shí),拉力可以刺激ERK1/2磷酸化,這一磷酸化出現(xiàn)的高峰在刺激15分鐘的時(shí)候,但是p3
5、8和JNK通路沒(méi)有變化。經(jīng)NMDA預(yù)處理之后,NMDA可以增強(qiáng)拉力刺激引起的ERK1/2磷酸化程度。U0126(ERK1/2通路的阻斷劑)可以阻斷NMDA以及拉力引起的成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物的增加,并且可以阻斷其ERK1/2信號(hào)通路磷酸化。 結(jié)論:NMDA可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化,這一效應(yīng)是通過(guò)激活ERK1/2,PKA,PKC,PI3K信號(hào)傳導(dǎo)通路起作用的。NMDA可以直接通過(guò)成骨細(xì)胞上NMDA受體發(fā)揮作用,這將是谷氨酸在骨改變上
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