工頻磁場暴露對大鼠內(nèi)嗅皮層鈣信號和谷氨酸受體表達的影響.pdf

1、科學(xué)技術(shù)進步日新月異，電子設(shè)備在各行各業(yè)被廣泛應(yīng)用，而隨之產(chǎn)生的電磁輻射逐漸被當做一種污染源充斥于人類的生存空間。電磁輻射(Electromagnetic field.EMF)按能量從高到低依次可以分為:微粒輻射、X-射線、紫外線、紅外線輻射、高頻及低頻輻射;按波譜來分主要可以分為電離類輻射和非電離輻射，包括射頻輻射（Radio frequency.RF）及極低頻電磁場(Extremely low frequency magneticf

2、ields-Electromagnetic field，ELF-EMF)。頻率為50HZ或60HZ的極低頻電磁場又稱為工頻磁場，由電場和磁場組成[1][2][3]。眾所周知，高能量的電離性質(zhì)的輻射及非電離輻射中的射頻輻射對人體存在較大的損害效應(yīng)。近年來，人們逐漸認識到能量相對較低的極低頻非電離性輻射特別是工頻磁場輻射對人體健康也同樣存在潛在的威脅。工頻磁場主要由家用電纜，工業(yè)電傳輸設(shè)備等產(chǎn)生。已有研究表明，工頻磁場暴露會使人類或動物的多

3、個系統(tǒng)發(fā)生病變，例如心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等。亦有文獻報道工頻磁場暴露與兒童白血病、腦腫瘤、免疫功能下降、過敏及炎癥反應(yīng)、乳腺癌、流產(chǎn)及心血管異常等多種疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系[2]。神經(jīng)系統(tǒng)是工頻磁場輻射損傷機體的一個重要的靶器官，人們發(fā)現(xiàn)工頻磁場輻射可以影響神經(jīng)系統(tǒng)的正?；顒蛹捌浣閷?dǎo)的不同神經(jīng)功能。已有文獻報道工頻磁場暴露與阿爾茨海默病、精力下降、學(xué)習(xí)記憶障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展存在著密切聯(lián)系[4][5]

4、。
　　認知功能是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多個認知腦區(qū)，包括海馬、內(nèi)嗅皮層、前額葉皮層等參與下進行的復(fù)雜的心理生理活動。這些相關(guān)腦區(qū)中存在多種與不同認知行為直接相關(guān)的神經(jīng)元[6]。早在19世紀人類就發(fā)現(xiàn)由輸電線纜產(chǎn)生的工頻磁場可能損害人的認知功能[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種形式的電磁輻射可以通過不同的機制影響海馬和前額葉的神經(jīng)活動，進而影響其介導(dǎo)的認知行為損傷。這些發(fā)現(xiàn)提示了我們一個重要訊息---低能量的工頻磁場可能對人們的認知功能存在損

5、害效應(yīng)[2]，然而目前關(guān)于工頻磁場是通過何種機制損害人的認知功能報道甚少。
　　內(nèi)嗅皮層(entorhinal cortex，EC)被認為是聯(lián)接海馬及皮層的“橋梁”，內(nèi)嗅皮層中存在空間信息編碼相關(guān)的功能神經(jīng)元，這些神經(jīng)元被認為與空間學(xué)習(xí)記憶有著密切的聯(lián)系[7]。為此，本研究以認知直接相關(guān)的內(nèi)嗅皮層為主要研究對象，從細胞、分子及行為水平，系統(tǒng)性地探索了工頻磁場對內(nèi)嗅皮層等認知腦區(qū)及其介導(dǎo)的認知行為的影響，以期對這一重要問題能夠有進一

6、步的認識。
　　首先我們觀察比較了工頻磁場輻照暴露組與偽暴露組的離體培養(yǎng)的大鼠內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元的鈣信號，然后觀察比較了兩組大鼠內(nèi)嗅皮層的谷氨酸受體表達差異，為同內(nèi)嗅皮層進行比較，我們也探測了其它認知腦區(qū)（海馬和前額葉皮層）谷氨酸受體表達的變化情況;基于谷氨酸受體在突觸可塑性及空間認知中的重要作用，最后我們采用T-迷宮實驗，探討了工頻輻照對大鼠空間工作記憶的影響。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1.工頻磁場暴露對內(nèi)嗅皮層神經(jīng)

7、元鈣信號的影響
　　原代培養(yǎng)乳大鼠內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元至第12天，將培養(yǎng)細胞分為暴露組和偽暴露組，在sXcELF系統(tǒng)下進入磁場暴露程序。暴露參數(shù)為:頻率50 Hz;強度1或3 mT;時間24小時;暴露模式為每啟動暴露5分鐘后，暫停暴露10分鐘。暴露完成后，立即進行全細胞膜片鉗實驗或細胞內(nèi)鈣熒光成像檢測。
　　(1)首先檢測了工頻磁場輻照對于培養(yǎng)的內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元全細胞電流的影響。工頻磁場（強度為1mT或者3 mT）24小時暴露對內(nèi)嗅

8、皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元的全細胞電流（在鉗制電位-70 mV的基礎(chǔ)上，以500 ms，-100至+40 mV的階躍命令電壓誘發(fā)）及電流密度（以膜電容平均化的電流強度）均無影響。我們同時也分析了這3組內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元的外向電流成分，包括瞬時外向電流成分以及持續(xù)性外向電流。統(tǒng)計結(jié)果顯示，對照組與輻照組間的瞬時外向電流成分以及持續(xù)性外向電流成分均無顯著性差異。
　　(2)工頻磁場（強度為1mT或者3 mT）24小時暴露并未影響內(nèi)嗅皮層原代培養(yǎng)神

9、經(jīng)元胞膜上的高閾值激活(HVA)鈣通道電流（在鉗制電位-50 mV的基礎(chǔ)上，以200 ms，-40～+40 mV的階躍命令電壓誘發(fā)）及電流密度。數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計證明，對照組與1 mT和3 mT輻照組間瞬時及持續(xù)HVA鈣通道電流成分大小均無顯著性差異，進一步分析比較3組間HVA鈣通道瞬時及持續(xù)電流成分的電流密度，發(fā)現(xiàn)上述3組間仍不存在顯著差異。
　　(3)工頻磁場（強度為1mT或者3 mT）24小時暴露未影響內(nèi)嗅皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元胞膜上

10、的低閾值激活(LVA)鈣通道電流（在鉗制電位-120 mV的基礎(chǔ)上，以200 ms，-70～-30 mV的階躍命令電壓誘發(fā)）及電流密度。分離的LVA鈣通道電流主要包括快速失活的瞬時電流成分。我們對其電流大小（峰值）進行計算并作出相應(yīng)I-V曲線后發(fā)現(xiàn)，對照組、1 mT輻照組和3 mT輻照組的LVA鈣通道電流均呈現(xiàn)出相似的電壓依賴性。數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計證明，3組間LVA鈣通道電流大小及相應(yīng)電流密度并不存在顯著性差異。以上結(jié)果提示，工頻磁場輻照對培

11、養(yǎng)的內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元電壓門控鈣通道的激活并無顯著影響。
　　(4)為了進一步研究工頻磁場輻照對培養(yǎng)的內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元電壓門控鈣通道失活特性的影響，我們在前述特異性分離出HVA以及LVA鈣通道電流的基礎(chǔ)上，進一步研究及分析了其穩(wěn)態(tài)失活特性。通過分析半失活電位和斜率因子，表明24小時工頻磁場（強度為1、3 mT）暴露對內(nèi)嗅皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元胞膜上的高閾值和低閾值激活鈣通道的失活也無影響。
　　(5)工頻磁場（強度為1mT或者3 mT

12、）24小時暴露對內(nèi)嗅皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元胞內(nèi)本底鈣離子濃度沒有影響，但影響了高鉀(10 mM)刺激在這些神經(jīng)元胞內(nèi)誘發(fā)的鈣動態(tài)變化，表現(xiàn)為劑量依賴地降低了高鉀引起的胞內(nèi)鈣濃度增加的最大值。
　　(6)使用Thapsigargin（TG，Ca2+-ATP酶抑制劑，5μM）清空內(nèi)嗅皮層原代培養(yǎng)神經(jīng)元胞內(nèi)鈣庫后，完全阻斷了工頻磁場（強度為1mT或者3mT）24小時暴露對高鉀(10mM)刺激誘發(fā)的神經(jīng)元胞內(nèi)鈣動態(tài)變化的影響。
　　2.

13、工頻磁場暴露對大鼠內(nèi)嗅皮層谷氨酸受體表達的影響
　　離子型谷氨酸受體在內(nèi)嗅皮層參與了興奮性突觸傳遞及可塑性，與學(xué)習(xí)記憶功能有密切關(guān)系。為此，我們進一步檢測了工頻輻照對內(nèi)嗅皮層的AMPA和NMDA受體亞基（AMPA受體:GluA1，GluA2，GluA3; NMDA受體:GluN1，GluN2A，GluN2B）的表達的影響。
　　(1)工頻磁場暴露14天（4小時/天，0.5mT）并未影響大鼠內(nèi)嗅皮層構(gòu)成AMPA受體主要亞基，即

14、GluA1，GluA2和GluA3表達水平。為了進行比較，我們也同時檢測了海馬和在前額葉皮層認知相關(guān)腦區(qū)的AMPA受體亞基的表達。同內(nèi)嗅皮層相同，14天工頻輻照也未影響海馬的AMPA受體亞基的表達。而在前額葉，GluA3的表達水平顯著地降低(n=5，P＜0.05)，與內(nèi)嗅皮層一樣，其余兩種亞基表達均未受到影響。
　　(2)工頻磁場暴露14天后，使得大鼠內(nèi)嗅皮層NMDA受體亞基GluN1和GluN2A蛋白的量有所增加(n=5，P＜0

15、.05)，但GluN2B蛋白的量未發(fā)現(xiàn)明顯變化。同內(nèi)嗅皮層相比，工頻輻照引起了前額葉皮層NMDA受體亞基相同的表達變化。在海馬，輻照同樣也增加了GluN2A蛋白量(n=5，P＜0.05)，引起了GluN2B表達上調(diào)(n=5，P＜0.05)，但GluN1未受影響。
　　(3)我們將相同的輻照暴露模式時間延長到28天，再次檢測內(nèi)嗅皮層中各種亞型的蛋白表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)嗅皮層AMPA受體的GluA2表達量減少(n=6，P＜0.05)，

16、其它亞基的表達量均未發(fā)生明顯變化(n=6，P＞0.05)。同內(nèi)嗅皮層相比，28天工頻磁場暴露均未影響海馬和前額葉的AMPA受體亞基的表達量。這些數(shù)據(jù)表明AMPA受體GluA2亞基在內(nèi)嗅皮層較海馬和前額葉對工頻輻照更為敏感。
　　(4)對于NMDA受體亞基，28天工頻磁場暴露之后，內(nèi)嗅皮層GluN2A表達量減少(n=6，P＜0.05)，而GluN2B的表達量有所增加(n=6，P＜0.05)，GluN1卻未發(fā)現(xiàn)明顯變化。與內(nèi)嗅皮層相同

17、，在海馬區(qū)，工頻磁場暴露28天后GluN2B表達也發(fā)生上調(diào)(n=6，P＜0.05)，并且GluN1未發(fā)現(xiàn)明顯變化。然而海馬的GluN2A較內(nèi)嗅皮層的敏感性低，在輻照暴露28天后未發(fā)生明顯改變。非常有意思的是，相對于內(nèi)嗅皮層，前額葉皮層GluN2A和GluN2B對28天工頻磁場暴露并不敏感，而其GluN1的表達卻在輻照暴露后上調(diào)。
　　(5)與此相同條件下，我們最后探討了工頻磁場輻射暴露對大鼠空間工作記憶的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著訓(xùn)練天

18、數(shù)的增加，大鼠在T-迷宮中的選擇正確率逐漸增加。然而，14天或28天的工頻磁場輻射連續(xù)暴露并沒有顯著影響大鼠的空間工作記憶，表明工頻輻照引起內(nèi)嗅皮層分子水平的變化不足以影響大鼠的空間工作記憶。
　　綜上，內(nèi)嗅皮層是工頻磁場輻照的易損腦區(qū)，工頻磁場輻照劑量依賴地降低了高K+引起的胞內(nèi)鈣濃度增加。與此同時，暴露于工頻磁場輻照環(huán)境中，大鼠的內(nèi)嗅皮層的AMPA和NMDA受體構(gòu)成發(fā)生顯著改變，但這些分子水平的改變并未顯著影響到大鼠的空間工作