谷氨酸NMDA受體拮抗劑MK801對邊緣葉癲癇發(fā)作大鼠多藥轉(zhuǎn)運體表達的影響.pdf

1、癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見的臨床綜合征，慢性、突發(fā)性和反復(fù)刻板發(fā)作為其主要臨床特點。盡管新抗癲癇藥(antiepileptic drugs，AEDs)不斷問世，但仍有30％患者的發(fā)作不能控制，成為難治性癲癇。這部分患者多為復(fù)雜部分性發(fā)作(多見于成人)和各種癲癇綜合征(多為兒童)，不僅對常規(guī)AEDs的反應(yīng)較差(具有耐藥性)，即使是新型AEDs對這部分癲癇患者的療效也不十分肯定。大量研究表明由于癲癇源性腦組織的血腦屏障(blood-brain ba

2、rrier,BBB)上具有藥物外排作用的多藥轉(zhuǎn)運體(multidrug transporters，MDTs)的過度表達，限制了腦組織對AEDs的攝取，影響了藥物到達作用靶點而形成耐藥。癲癇發(fā)作可引起MDTs的過度表達，癲癇發(fā)作又引起谷氨酸釋放增加，谷氨酸通過活化NMDA受體上調(diào)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞P-gp的表達，提示癲癇發(fā)作后MDTs的過度表達可能與NMDA 受體的活化有關(guān)，我們首先觀察邊緣葉癲癇發(fā)作大鼠模型癲癇持續(xù)狀態(tài)(status

3、epilepticus，SE)后72 h內(nèi)海馬MDTs的表達變化；然后分別在SE后MDTs mRNA 和蛋白表達最高時點觀察NMDA受體拮抗劑MK801對MDTs表達的影響；最后在細(xì)胞水平觀察谷氨酸刺激對大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rat brainmicrovessel endothelial cells.RBMECs)mrp2 mRNA表達和外排功能的影響，以及MK801預(yù)處理后對谷氨酸作用的影響。 第一部分：多藥轉(zhuǎn)運體在邊緣葉癲

4、癇發(fā)作后的動態(tài)表達變化。 目的： 探討SE終止后72 h內(nèi)P-gP、Mrp2、Bcrp表達的時間規(guī)律，明確MDTs表達的細(xì)胞類型分布。 材料與方法： 制備氯化鋰一匹羅卡品癲癇發(fā)作大鼠模型，用實時熒光定量RT-PCR法檢測SE終止后0 h、3 h、6 h、24 h、72 h和control組海馬組織P-gp、Mrp2、Bcrp、Ralbpl、Pxr的mRNA表達；Westem blot檢測SE終止后3 h、

5、6 h、24 h、72 h和control組海馬組織P-gP、Mrp2、Bcrp的蛋白表達；免疫熒光檢測SE終止后24 h和對照組P-gP、Mrp2,Bcrp分別與vWF、MAP2、GFAP 雙標(biāo)染色，以上各組每組6只大鼠。 結(jié)論：癲癇發(fā)作誘導(dǎo)P-gp、Mrp2、Bcrp暫時性過度表達，癲癇發(fā)作可誘導(dǎo)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達以上3種MDTs。 第二部分：谷氨酸NMDA受體拮抗劑MKS01對癲癇發(fā)作后多藥轉(zhuǎn)運體P-gp、M

6、rp2、Bcrp表達的影響。 目的： 觀察NMDA受體對邊緣葉癲癇大鼠發(fā)作后P-gp、Mrp2、Bcrp表達的影響，探討NMDA受體是否能對癲癇發(fā)作后上述3種MDTs的表達進行調(diào)控。 材料與方法： 動物共分為3組：control、MK801和SE組，SE組即氯化鋰—匹羅卡品癲癇發(fā)作大鼠模型組，MK801組即SE組加MK801(0.5 mg/kg)預(yù)處理組，control組即除匹羅卡品改用生理鹽水代替外，其

7、他給藥同SE組。使用實時熒光定量RT-PCR 和 Westem blot分別檢測P-gp、Mrp2、Bcrp mRNA(SE終止后6 h)和蛋白(SE終止后24h)表達，使用免疫組化檢測SE終止后24 h時上述3種MDTs 的表達分布。 結(jié)論： NMDA受體拮抗劑MK801能逆轉(zhuǎn)癲癇發(fā)作后P-gp、Mrp2、Bcrp的過度表達，NMDA受體的活化參與介導(dǎo)癲癇發(fā)作后P-gp、Mrp2、Bcrp的過度表達。在邊緣腦區(qū)和大腦皮

8、層中，SE組上述3種MDTs表達較control組明顯增加，大多：MK801組明顯低于SE組，并與control組表達水平相當(dāng)。 第三部分：谷氨酸、NMDA受體拮抗劑MK801對大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞mrp2mRNA表達和外排功能的影響。 目的： 觀察谷氨酸對RBMECs上mrp2 mRNA表達和外排轉(zhuǎn)運功能的影響，探討NMDA受體是否影響谷氨酸刺激RBMECs后mrp2 mRNA和外排轉(zhuǎn)運功能的變化。 材

9、料與方法： 分離2周齡SD大鼠的大腦皮層微血管段，并進行原代RBMECs培養(yǎng)。待RBMECs生長至融合后，進行以下實驗。MTT法檢測不同濃度谷氨酸刺激對RBMECs活力的影響，細(xì)胞分組：control組，不給任何特殊處理；Glu組，給100μM谷氨酸刺激30 min后吸去上清，再培養(yǎng)24 h；MK801組，加入谷氨酸前，用100μM K801預(yù)處理15 min，其他處理同Glu組。實時熒光定量RT-PCR檢測mrp2 mRNA的

10、表達。底物外排實驗檢測不同干預(yù)對RBMECs上Mrp2外排轉(zhuǎn)運功能的影響。 結(jié)論： 谷氨酸刺激RBMECSs可誘導(dǎo)mrp2 mRNA表達和外排轉(zhuǎn)運功能的增強，NMDA受體的拮抗劑可完全逆轉(zhuǎn)谷氨酸的這一作用。 本文結(jié)論: 1、癲癇發(fā)作誘導(dǎo)P-gp、Mrp2、Berp暫時性過度表達，癲癇發(fā)作可誘導(dǎo)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達以上3種MDTs。 2、NMDA受體拮抗劑MK801能逆轉(zhuǎn)癲癇發(fā)作后P-gP、Mr