椎管內(nèi)給予NMDA受體激動劑NMDA激活大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞.pdf

1、目的：目前，病理性疼痛的產(chǎn)生機(jī)制已經(jīng)從單獨(dú)的神經(jīng)元機(jī)制，轉(zhuǎn)向了神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞相互作用機(jī)制，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)定居的吞噬細(xì)胞和主要免疫反應(yīng)細(xì)胞受到了廣泛的關(guān)注。大量研究表明，在外周神經(jīng)損傷和傷害性刺激后，脊髓后角的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，合成和分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子包括白介素(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-a)、前列腺素(PGE2)和一氧化氮(NO)等，促進(jìn)病理性疼痛和痛覺敏感的產(chǎn)生。給予小膠質(zhì)細(xì)胞功能或代謝的抑制藥物

2、如米諾環(huán)素或一些受體的抑制劑，則可明顯地對病理性疼痛和痛覺過敏產(chǎn)生抑制作用。這些研究結(jié)果表明脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的活化在調(diào)節(jié)病理性疼痛和痛覺過敏的過程中發(fā)揮重要作用。然而，病理性疼痛過程中脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化機(jī)制仍然不十分清楚。
　　N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體是興奮性氨基酸受體的一種亞型，屬于離子型受體，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在脊髓的小膠質(zhì)細(xì)胞上也有分布。生理條件下，該受體參與調(diào)節(jié)

3、神經(jīng)系統(tǒng)生長、發(fā)育，學(xué)習(xí)、記憶等復(fù)雜的生理功能。病理情況下，激活的NMDA受體引起細(xì)胞內(nèi)一系列級聯(lián)放大效應(yīng)，增強(qiáng)突觸前和突出后神經(jīng)元的興奮性，從而參與介導(dǎo)傷害性信息的傳遞與整合，在病理性疼痛和痛覺過敏形成過程中發(fā)揮重要作用。
　　我室以往應(yīng)用免疫印跡分析和免疫組化技術(shù)，觀察到椎管內(nèi)注射NMDA受體非競爭性拮抗劑MK-801可抑制蜜蜂毒疼痛模型引起的脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，初步證明NMDA受體在引起脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞激活中的作用。

4、
　　本實(shí)驗則采用免疫組化技術(shù)，觀察椎管內(nèi)給予NMDA受體選擇性激動劑NMDA對脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響，進(jìn)一步研究NMDA及其受體在傷害性信息傳入所致脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞激活中的作用，為闡明病理性疼痛及痛覺過敏過程中脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活的機(jī)制提供實(shí)驗依據(jù)。
　　方法：雄性Sprague-Dawley大鼠95只，體重260-280g，隨機(jī)分為以下各組(n=5)。
　　sham組：椎管內(nèi)注射生理鹽水10μl，于相應(yīng)的時間點(diǎn)測

5、定熱輻射縮足潛伏期、熱甩尾潛伏期和機(jī)械刺激縮足閾值后，取腰5脊髓節(jié)段，觀察脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b/e(OX-42)的表達(dá)。
　　NMDAⅠ組：椎管內(nèi)注射NMDA溶液10μl(10 nmol)，分別于注射后1 h、4 h、8 h、12 h、1 d、2 d和3 d測定熱輻射縮足潛伏期、熱甩尾潛伏期和機(jī)械刺激縮足閾值后，取腰5脊髓節(jié)段，觀察脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b/c(OX-42)表達(dá)的時間變化特點(diǎn)，分析CD11b/c(OX-

6、42)的表達(dá)與痛覺過敏的時間對應(yīng)關(guān)系。
　　NMDAⅡ組：椎管內(nèi)注射NMDA溶液10μl。根據(jù)NMDA的劑量，進(jìn)一步分為0.1 nmol，1 nmol和10 nmol三個亞組。每組動物于椎管內(nèi)注射后8 h測定熱輻射縮足潛伏期、熱甩尾潛伏期和機(jī)械刺激縮足閾值后，取腰5脊髓節(jié)段，觀察NMDA上調(diào)脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b/c(OX-42)的表達(dá)和導(dǎo)致痛覺過敏的劑量依賴性。
　　MK-801+NMDA組：首先椎管內(nèi)注射NMDA受

7、體抑制劑MK-801溶液10μl(50 nmol)，15 min后椎管內(nèi)注射NMDA溶液10μl(10 nmol)，注射NMDA8 h測定熱輻射縮足潛伏期、熱甩尾潛伏期和機(jī)械刺激縮足閾值后，取腰5脊髓節(jié)段，觀察MK-801對NMDA引起的脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b/c(OX-42)表達(dá)的上調(diào)和痛覺過敏的影響。
　　以上各組動物均于相應(yīng)時間點(diǎn)多聚甲醛灌注固定，取腰5(L5)脊髓節(jié)段，冰凍連續(xù)切片，免疫組化法觀察L5脊髓后角CD11

8、b/c(OX-42)表達(dá)，反映脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞激活的狀態(tài)。
　　數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件13.0對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，比較組間差異。有顯著差異者用最小顯著差法進(jìn)行兩兩比較，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1痛行為反應(yīng)
　　1.1自發(fā)痛行為反應(yīng)椎管內(nèi)注射NMDA后大鼠可出現(xiàn)緊張性的咬、舔后足或尾、肢體扭動和吱叫等特征性的傷害性

9、行為反應(yīng)，而椎管內(nèi)預(yù)先注射MK-801(MK-801+NMDA組)則可抑制上述表現(xiàn)。
　　1.2熱縮足和熱甩尾潛伏期在NMDAⅠ組，椎管內(nèi)注射NMDA(10 nmol)后1 h，大鼠的熱縮足潛伏期開始縮短(p<0.05)，可持續(xù)到12 h。熱縮足潛伏期1 d時恢復(fù)到sham水平，表明椎管內(nèi)注射NMDA后早期就可出現(xiàn)熱痛覺過敏，并且這種現(xiàn)象可持續(xù)一段時間。在NMDAⅡ組，NMDA組的熱縮足潛伏期縮短呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，表現(xiàn)為隨著

10、NMDA注射劑量的增大，熱縮足潛伏期的縮短逐漸明顯。MK-801+NMDA組與相同劑量NMDA組相比，熱縮足潛伏期顯著延長(p<0.05)，表明椎管內(nèi)注射MK-801可抑制上述熱痛覺過敏。熱甩尾潛伏期的變化特點(diǎn)與熱縮足潛伏期相似。
　　1.3機(jī)械縮足反射閾值在NMDAⅠ組，大鼠椎管內(nèi)注射NMDA后4 h機(jī)械縮足反射閾值開始出現(xiàn)降低(p<0.05)，可延長至椎管內(nèi)注射NMDA后1 d。機(jī)械縮足反射閾值2 d時恢復(fù)到sham水平，表明

11、椎管內(nèi)注射NMDA后早期也可以表現(xiàn)出機(jī)械痛覺過敏，并且這種表現(xiàn)可持續(xù)較長時間。在NMDAⅡ組，NMDA組的機(jī)械縮足反射閾值降低呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，表現(xiàn)為隨著NMDA注射劑量的增大，機(jī)械縮足反射閾值減小逐漸明顯。MK-801+NMDA組與相同劑量NMDA組相比，機(jī)械縮足反射閾值明顯增高(p<0.05)，表明椎管內(nèi)注射MK-801可抑制上述機(jī)械痛覺過敏。
　　2脊髓后角CD11b/c(OX-42)表達(dá)變化與sham組相比，椎管內(nèi)注

12、射NMDA4 h后，脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b/c(OX-42)的表達(dá)明顯升高(p<0.05)，鏡下觀察小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，其特征為胞體明顯變大，突起增粗變短，染色加深。上述CD11b/c(OX-42)的表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)變化在注射NMDA8 h后達(dá)到高峰，1 d后開始減弱，3 d基本恢復(fù)到sham水平。隨著大鼠椎管內(nèi)給予NMDA劑量的增加(0.1 nmol，1 nmol和10 nmol)，脊髓后角CD11b/c(OX-42)表達(dá)逐

13、漸升高，呈明顯的劑量依賴性。預(yù)先椎管內(nèi)注射NMDA受體阻斷劑MK-801可顯著抑制上述NMDA引起的CD11b/c(OX-42)表達(dá)的上調(diào)(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1椎管內(nèi)注射NMDA受體特異性激動劑NMDA可以引起傷害性感受和痛覺過敏，這種傷害性行為可被NMDA受體非競爭性抑制劑MK-801在一定程度上所抑制。
　　2椎管內(nèi)注射NMDA受體特異性激動劑NMDA可以引起脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞活化，這種變化呈現(xiàn)一定