NMDA受體激動劑NMDA上調大鼠脊髓后角星形膠質細胞特異性蛋白GFAP和小膠質細胞特異性蛋白CD11b的表達.pdf

1、目的：研究表明，脊髓神經(jīng)膠質細胞的激活在病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展和維持過程中發(fā)揮重要的作用?；罨纳窠?jīng)膠質細胞釋放的促炎物質，如白介素、腫瘤壞死因子等，可以增強神經(jīng)元的興奮性，提高疼痛敏感性。早期給予米諾環(huán)素，四環(huán)素類藥物等神經(jīng)膠質細胞抑制劑可以抑制神經(jīng)炎癥的發(fā)生，阻止星形膠質細胞和小膠質細胞的激活。但在病理性疼痛發(fā)生發(fā)展的過程中，脊髓神經(jīng)膠質細胞的激活及其作用機制尚不完全清楚。
　　興奮性氨基酸及其受體，特別是N-甲基-D-天門冬

2、氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)及其受體在脊髓傷害性信息傳遞過程中發(fā)揮重要的作用。NMDA受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中興奮性氨基酸受體的一種亞型，屬于離子型受體，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。脊髓中興奮性氨基酸及其NMDA受體的異常活動可導致脊髓的中樞敏化，參與自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏的形成。研究提示，NMDA受體參與神經(jīng)病理性疼痛模型中脊髓后角膠質細胞的激活。但外周炎性痛過程中脊髓后角膠質細胞激活的機制尚不

3、清楚。我室既往應用免疫印跡分析技術和免疫組化技術發(fā)現(xiàn)，給大鼠足底注射蜜蜂毒使大鼠發(fā)生傷害性感受的同時，脊髓后角星形膠質細胞標記物膠質纖維酸性蛋白(glial fibrilary acidic protein，GFAP)和小膠質細胞標記物CD11b/c(OX-42)蛋白表達增加。預先椎管內注射NMDA受體阻斷劑MK-801可以抑制蜜蜂毒引起的GFAP和CD11b表達的上調。這些結果初步提示NMDA受體的激活是介導炎性痛及痛過敏過程中脊髓后

4、角星形膠質細胞和小膠質細胞激活的原因之一。
　　本課題在此基礎上，采用免疫印跡分析(western blot)技術，進一步觀察大鼠鞘內注射NMDA受體特異性激動劑NMDA對GFAP和CD11b兩種蛋白表達的影響，為闡明NMDA受體激活在傷害性信息傳入引起的脊髓后角膠質細胞激活中的作用提供進一步的實驗依據(jù)。
　　方法：雄性Sprague-Dawley大鼠120只，體重210-220 g，隨機分為以下各組：
　?、賡ham

5、組：椎管內注射生理鹽水10μl。于相應時間點取材觀察。
　?、贜MDA時間依賴組：鞘內注射NMDA溶液10μl(10 nmol)分別于椎管內注射后1h、4h、8h、12 h、1d、2d、3d取材，觀察腰5節(jié)段脊髓后角GFAP和CD11b蛋白表達的時間特點。取材之前測定機械刺激縮足閾值、熱輻射縮足潛伏期和熱甩尾潛伏期。對比分析GFAP和CD11b的表達與痛覺過敏的時間對應關系。
　?、跱MDA劑量依賴組：鞘內注射NMDA溶液1

6、0μl。根據(jù)NMDA的注射劑量，進一步分為0.1 nmol、1 nmol和10 nmol三個亞組。各組動物在鞘內注射之后8h取材，觀察NMDA上調大鼠腰5節(jié)段脊髓后角GFAP和CD11b蛋白表達的劑量依賴性。取材之前測定機械刺激縮足閾值、熱輻射縮足潛伏期和熱甩尾潛伏期。對比分析GFAP和CD11b的表達與痛覺過敏的劑量對應關系。
　　④MK-801+NMDA組：首先鞘內注射NMDA受體抑制劑MK-801生理鹽水溶液10μl(50

7、nmol)，15 min后鞘內注射NMDA溶液10μl(10nmol)。在注射NMDA之后8h取材，觀察MK-801對NMDA引起的腰5節(jié)段脊髓后角GFAP和CD11b蛋白表達上調的影響。取材之前測定機械刺激縮足閾值、熱輻射縮足潛伏期和熱甩尾潛伏期。對比分析預先給予MK-801大鼠GFAP和CD11b的表達與痛覺過敏的對應關系。
　　以上各組動物在預定時間點取材，應用western blot方法測定其脊髓后角GFAP和CD11b的

8、表達，以反映脊髓后角星形膠質細胞和小膠質細胞的激活狀態(tài)。每組10只大鼠，其中5只用于GFAP的測定，5只用于CD11b的測定。
　　數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±S)表示。采用社會科學統(tǒng)計程序(StatisticalProgram for Social Sciences13.0)進行單因素方差分析(One-WayANOVA)，比較組間差異，有顯著差異者用最小顯著差法(least significantdifference)進行兩兩比較，

9、以p＜0.05作為判斷差異顯著性的標準。
　　結果：
　　1痛行為反應
　　1.1自發(fā)痛行為反應椎管內注射NMDA以后大鼠出現(xiàn)了特征性的傷害性行為反應，包括一些緊張性的咬、抓、舔、吱叫和扭體等。隨著時間的延長，這種痛行為反應逐漸消失。預先給予NMDA受體抑制劑MK-801可以減輕大鼠出現(xiàn)的上述反應。
　　1.2機械縮足反射閾值大鼠椎管內注射NMDA10 nmol以后4h，大鼠的機械縮足反射閡值開始出現(xiàn)降低(P＜0

10、.05)，并持續(xù)到給予NMDA后1d，2d時逐漸恢復至sham組水平，表明椎管內注射NMDA后早期就已經(jīng)出現(xiàn)機械痛覺過敏，而且這種痛覺過敏可持續(xù)一定的時間。上述椎管內注射NMDA引起的痛覺過敏呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表現(xiàn)為隨著NMDA劑量的增大，機械縮足反射閾值逐漸減小。鞘內預先給予MK-801可以在一定程度上阻斷NMDA引起的機械縮足反射閾值的減小。
　　1.3熱輻射縮足和熱甩尾潛伏期大鼠椎管內注射NMDA10 nmol以后1h，

11、大鼠的熱輻射縮足和熱甩尾潛伏期開始縮短(P＜0.05)，并持續(xù)到椎管內給予NMDA后12 d，1d時逐漸恢復至sham水平，表明椎管內注射NMDA后早期就已經(jīng)出現(xiàn)熱痛覺過敏，而且這種熱痛覺過敏可持續(xù)一定的時間。上述椎管內注射NMDA引起的痛覺過敏呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表現(xiàn)為隨著NMDA注射劑量的增大，熱輻射縮足和熱甩尾潛伏期逐漸縮短。鞘內預先給予MK-801可以在一定程度上阻斷NMDA引起的熱輻射縮足和熱甩尾潛伏期的縮短。
　　2

12、脊髓后角GFAP的表達椎管內注射NMDA溶液10μl(10 nmol)后1h，脊髓后角GFAP的表達與sham組相比開始增加(P＜0.05)，8h達到高峰，隨后逐漸下調，至3d時基本恢復到sham組水平。上述GFAP表達上調的時間過程與椎管內注射NMDA后痛行為表現(xiàn)的時間特征基本一致。隨著大鼠椎管內給予NMDA劑量的增加(0.1 nmol，1 nmol和10nmol)，脊髓后角GFAP的表達也逐漸升高，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。預先椎管內

13、給予NMDA受體阻滯劑MK-801可明顯抑制上述NMDA引起的GFAP表達的上調(P＜0.05)。
　　3脊髓后角CD11b的表達與sham組相比，大鼠椎管內注射NMDA溶液10μl(10 nmol)后1 h，脊髓后角CD11b的表達開始上調(P＜0.05)，4h逐漸增多，至8h達到高峰，隨后表達量逐漸下調，至3d時基本恢復到sham組水平。隨著大鼠椎管內給予NMDA劑量的增加(0.1 nmol，1 nmol和10 nmol)，脊

14、髓后角CD11b的表達也逐漸升高，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。預先椎管內給予NMDA受體阻滯劑MK-801可明顯抑制上述NMDA引起的CD11b表達的上調(P<0.05)。
　　結論：
　　1大鼠椎管內注射NMDA受體特異性激動劑NMDA可以劑量依賴性地上調脊髓后角GFAP和CD11b蛋白的表達，GFAP和CD11b表達上調的時間特點與椎管內注射NMDA引起的痛行為反應時間特點基本一致。
　　2 NMDA受體非競爭性抑制劑