芳香烴受體核易位蛋白ARNT2對(duì)肝癌增殖的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(肝癌)是我國(guó)常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率均位列惡性腫瘤第二位。肝癌的高侵襲、易復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移特征已成為制約患者長(zhǎng)期生存改善的瓶頸。探索肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制、尋找新的干預(yù)手段是從事肝癌臨床和基礎(chǔ)研究工作者不得不面臨和克服的一大挑戰(zhàn)。
　　前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),芳香烴受體核易位蛋白ARNT可以抑制肝癌增殖,而與ARNT具有高度同源序列的ARNT2在肝癌中的作用報(bào)道甚少。本研究首先觀察ARNT2在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)與肝癌患者

2、術(shù)后預(yù)后的關(guān)系;然后探討ARNT2表達(dá)改變對(duì)肝癌生長(zhǎng)的影響:最后進(jìn)一步明確ARNT2調(diào)控肝癌增殖的分子機(jī)制。
　　第一部分
　　芳香烴受體核易蛋白ARNT2在在肝癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系
　　目的:比較ARNT2在肝癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異,分析ARNT2在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)與原發(fā)性肝癌預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:應(yīng)用組織微陣列技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色方法,回顧性研究195例行手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的肝細(xì)胞癌

3、標(biāo)本(癌和癌旁組織)中ARNT2的表達(dá)情況,Log-rank法比較肝癌中不同ARNT2表達(dá)組間生存率和復(fù)發(fā)率的差別,COX回歸模型進(jìn)行單因素、多因素分析各有關(guān)因素對(duì)患者生存率和復(fù)發(fā)率的影響。
　　結(jié)果:免疫組化顯示ARNT2主要表達(dá)在胞質(zhì),肝癌和癌旁的表達(dá)量分別為0.298±0.01939,0.080±0.00796,兩者間的差異明顯(p＜0.001)。腫瘤ARNT2的表達(dá)與患者年齡(p=0.019),腫瘤大小(p=0.003),

4、腫瘤的分化(p=0.002),TNM分期(p=0.001),門脈癌栓(p=0.02)以及AFP的表達(dá)(p＜0.001)均相關(guān)。同時(shí),ARNT2的表達(dá)與患者的生存和復(fù)發(fā)顯著相關(guān),高表達(dá)組患者的總體生存率顯著高于低表達(dá)組,復(fù)發(fā)率顯著低于低表達(dá)組(分別p＜0.001和p=0.004)。COX回歸模型單因素分析發(fā)現(xiàn)腫瘤大小、TNM分期、癌栓和癌內(nèi)ARNT2表達(dá)是影響肝癌患者總體生存的相關(guān)因素,而且腫瘤大小、TNM分期、癌栓、AFP的水平和癌內(nèi)A

5、RNT2表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān);多因素分析則發(fā)現(xiàn)癌內(nèi)ARNT2表達(dá)是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。
　　結(jié)論:ARNT2在肝癌的預(yù)后中發(fā)揮了重要的作用,癌內(nèi)ARNT2高表達(dá)是影響肝癌預(yù)后的保護(hù)性因素。
　　第二部分芳香烴受體核易位蛋白ARNT2表達(dá)改變對(duì)肝癌增殖以及侵襲能力的影響
　　目的:明確ARNT2表達(dá)對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝癌增殖以及侵襲能力影響。
　　方法:構(gòu)建靶向Arnt2的干擾性和過(guò)表達(dá)慢病毒載體pLentiARN

6、T2i、pLentiARNT20x,轉(zhuǎn)染HCCLM6細(xì)胞,篩選出GFP穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株,經(jīng)RT-PCR和WesternBlotting驗(yàn)證ARNT2表達(dá)改變后,分別用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖、Boyden小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力變化。同時(shí)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi),研究ARNT2表達(dá)改變后,裸鼠體內(nèi)肝癌生長(zhǎng)速度的改變。
　　結(jié)果:靶向Amt2的重組慢病毒載體pLentiARNT2i和pLentiARNT20x轉(zhuǎn)染HCCLM6

7、細(xì)胞,篩選出兩株ARNT2表達(dá)改變明顯的穩(wěn)定細(xì)胞株LentiARNT2i和LentiARNT20x;CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示LentiARNT2i細(xì)胞增殖最快,LentiARNT20x增殖最慢;LentiARNT2i侵襲和運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng),LentiARNT20x細(xì)胞侵襲和運(yùn)動(dòng)能力較對(duì)照組明顯減弱;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ARNT2低表達(dá)組腫瘤生長(zhǎng)加快,ARNT2高表達(dá)組腫瘤生長(zhǎng)明顯減緩。
　　結(jié)論:ARNT2與肝癌的生長(zhǎng)增殖呈負(fù)相關(guān),具

8、有抑制肝癌生長(zhǎng)與增殖的作用。
　　第三部分ARNl2抑制肝癌增殖的機(jī)制研究
　　目的:探討ARNT2抑制肝癌增殖的分子機(jī)制。
　　方法:用Illumina’sSolexa測(cè)序法檢測(cè)ARNT2表達(dá)改變后,基因轉(zhuǎn)錄組的變化。
　　結(jié)果:Solexa測(cè)序發(fā)現(xiàn)BRAF、ARAF、CRAF、KRAS、NRAS、SMEK1、SMEK2、CERK、CERKL、SMEK3P等基因在Mock,LentiARNT2i以及LentiA