花色苷通過(guò)AMPK減少肝臟HepG2細(xì)胞的脂肪積聚.pdf

1、肝臟是脂類合成代謝和分解代謝的中心器官。正常情況下，肝臟內(nèi)總脂肪含量占肝臟重量的4％～5％，大約是60～80克，其中半數(shù)以上為磷脂，中性脂肪甘油三酯和脂肪酸含量很少。如果肝臟內(nèi)脂肪的分解與合成代謝失去平衡，或運(yùn)出發(fā)生障礙，脂肪(主要是甘油三酯和脂肪酸)就會(huì)在肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)量積聚。 不同病因引起肝臟脂肪積聚的機(jī)理各異，一般認(rèn)為，進(jìn)入肝臟的脂肪酸過(guò)多、肝內(nèi)形成的甘油三酯增多或氧化減少、脂蛋白的合成減少導(dǎo)致脂肪的運(yùn)輸障礙等是肝臟脂肪積聚的

2、三個(gè)基本環(huán)節(jié)。 肝臟脂肪積聚會(huì)引發(fā)一系列的嚴(yán)重后果：對(duì)肝臟自身的損害，目前在脂肪肝的發(fā)病機(jī)制中廣為接受的是“二次打擊學(xué)說(shuō)”，脂肪積聚引起肝臟脂肪變性，形成“第一次打擊”，在此狀態(tài)下更易于受到氧化應(yīng)激等因素的“第二次打擊”，加速肝細(xì)胞受損，進(jìn)展為肝纖維化和肝硬化，甚至肝癌；對(duì)肝外器官的損害，非脂細(xì)胞內(nèi)堆積的脂質(zhì)極易通過(guò)非氧化代謝途徑產(chǎn)生脂肪中毒，并誘導(dǎo)胰島素抵抗。因脂質(zhì)異位相關(guān)代謝異?？尚纬筛喾磻?yīng)性脂簇，其典型代表神經(jīng)酰胺對(duì)胰島

3、β細(xì)胞和肝細(xì)胞等都有毒性(脂毒性)，而游離脂肪酸可直接抑制胰島素受體底物-1酪氨酸的磷酸化，造成肝臟和外周IR；對(duì)全身的損害，通過(guò)加劇代謝紊亂，促進(jìn)2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，導(dǎo)致代謝綜合征相關(guān)的腫瘤和心腦血管事件高發(fā)，而這些疾病反過(guò)來(lái)又促進(jìn)肝臟疾病的進(jìn)展，增加惡性腫瘤和心腦血管事件的發(fā)生。因此，減少肝臟脂肪積聚不但能夠直接減輕肝臟損傷，還能夠間接改善胰島素抵抗，減緩代謝綜合征的發(fā)生和進(jìn)展。目前，治療肝臟脂肪積聚的方法主要是針對(duì)原發(fā)

4、病因，包括運(yùn)動(dòng)和飲食療法等，臨床上也有應(yīng)用藥物治療嚴(yán)重的肝臟脂肪積聚，但是大多具有一定的副作用，因而尋找安全有效的天然化學(xué)物質(zhì)意義重大。 腺苷酸激活蛋白激酶是在肝臟、心臟、骨骼肌中調(diào)節(jié)能量和代謝平衡的一種蛋白激酶，它廣泛存在于真核生物的細(xì)胞中，屬于絲／蘇氨酸蛋白激酶家族成員。當(dāng)代謝性應(yīng)激引起細(xì)胞內(nèi)AMP／ATP比值升高時(shí)，AMPK發(fā)生磷酸化并激活其下游的多種靶分子，減少ATP的消耗和增加ATP的生成，即促進(jìn)分解代謝；反之，當(dāng)AM

5、P／ATP比值降低時(shí)，AMPK則促進(jìn)合成代謝。AMPK的這一作用被形象地比喻為“調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的開(kāi)關(guān)”，其本身也被稱為“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”。AMPK活化后，可以促進(jìn)乙酰輔酶A羧化酶磷酸化使其活性降低，減少丙二酰輔酶A合成，從而增強(qiáng)脂肪酸氧化限速酶——肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-I的活性，促進(jìn)脂肪酸氧化。由于AMPK控制脂肪酸氧化的細(xì)胞信號(hào)途徑包括AMPK、ACC和CPI-I，又有人稱之為“AMPK-ACC-CPT-I信號(hào)通路”。除此之外，ACC也是

6、脂肪合成的限速酶，AMPK的活化還能夠減少脂肪的合成。因此，AMPK有可能是調(diào)節(jié)脂肪含量、影響脂質(zhì)代謝平衡的重要靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)肝臟AMPK有可能會(huì)影響肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量。 大量流行病學(xué)資料表明，植物性食物具有廣泛的促進(jìn)健康和預(yù)防疾病的作用，這一方面取決于食物中營(yíng)養(yǎng)素的合理構(gòu)成，另一方面取決于植物性食物中存在的大量植物化學(xué)物。植物化學(xué)物的生物學(xué)效應(yīng)已經(jīng)成為目前營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究領(lǐng)域的重要熱點(diǎn)之一。花青素是自然界分布最廣泛的水溶性植物色素之一，

7、屬黃酮類化合物，自然狀態(tài)下常與各種單糖形成糖苷，稱為花色苷，大部分以花和果實(shí)為可食部分的植物性膳食中都有不同程度的存在。花色苷最突出的作用就是使植物呈現(xiàn)五彩繽紛的顏色，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其有很多獨(dú)特的生理功能，尤其是在抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗血管增生及抗突變等方面的生理作用引起了廣泛的關(guān)注。 研究發(fā)現(xiàn)，富含花色苷的食物可以改善高脂誘導(dǎo)的小鼠肥胖，降低ApoE基因缺陷小鼠的血脂水平，減少組織中的脂肪和膽固醇沉積，促進(jìn)膽固醇外流，抑制CD4

8、0誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果提示我們，花色苷在防治慢性非傳染性疾病方面，可能具有潛在的功效。而本實(shí)驗(yàn)室在既往的研究中也發(fā)現(xiàn)，黑米花色苷提取物能夠顯著減少高脂誘導(dǎo)肥胖大鼠的肝臟脂肪積聚，其機(jī)制可能與上調(diào)肝臟線粒體CPT-I mRNA表達(dá)水平有關(guān)。 本次研究擬采用HepG2細(xì)胞模型，觀察花色苷單體矢車菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin 3-O-β-glucoside，Cy-3-g)對(duì)AMPK活化、脂肪酸β-氧化和甘油三酯含量

9、的影響，明確花色苷是否能夠通過(guò)AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞脂肪積聚，為花色苷在防治疾病和促進(jìn)健康方面的研究和應(yīng)用豐富新的內(nèi)容。 研究目的： 1.研究花色苷Cy-3-g對(duì)HepG2細(xì)胞脂肪含量的影響2.探討花色苷Cy-3-g影響HepG2細(xì)胞脂肪積聚的可能機(jī)制及其與AMPK的關(guān)系研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組生長(zhǎng)良好的HepG2細(xì)胞分別用1μM、10μM、100μM Cy-3-g處理1h；用不加任何干預(yù)的細(xì)胞作為對(duì)照(c

10、ontrol)，用1mM的AMPK激動(dòng)劑AICAR作為陽(yáng)性對(duì)照。 2.花色苷Cy-3-g對(duì)HepG2細(xì)胞甘油三酯(Triglyceride，TG)含量的影響將HepG2細(xì)胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集細(xì)胞用試劑盒檢測(cè)。 3花色苷Cy-3-g對(duì)HepG2細(xì)胞脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，F(xiàn)AO)的影響將HepG2細(xì)胞在無(wú)血清1640培養(yǎng)基中饑餓

11、6～8h，用花色苷干預(yù)1h，每孔加入3H-棕櫚酸2μCi／mL、L-卡尼丁(L—carnitine)1 mmol／L，孵育后吸棄培養(yǎng)基，測(cè)定3H2O放射性。 4.花色苷Cy-3-g對(duì)HepG2細(xì)胞CPT-I水平和ACC磷酸化的影響將HepG2細(xì)胞饑餓6～8h后，分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mMAICAR孵育1h，收集細(xì)胞總蛋白用于Western blot檢測(cè)。 5.花色苷Cy-3-g對(duì)AMPK活性

12、的影響將HepG2細(xì)胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR孵育1h后，收集細(xì)胞總蛋白，用免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)檢測(cè)AMPK活性。 6.花色苷Cy-3-g對(duì)AMPK及其磷酸化水平的影響將HepG2細(xì)胞分別與1μM、10μM、100μM Cy-3-g和lmM AICAR孵育1h后，收集細(xì)胞總蛋白用于Western blot檢測(cè)。 研究結(jié)果： 1.花色苷

13、對(duì)HepG2細(xì)胞甘油三酯含量的影響與對(duì)照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著減少HepG2細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯含量(p<0.05)，甘油三酯含量分別減少了8.3％、15.8％、44.1％，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比，分別相當(dāng)于1mMAICAR處理組的43.6％、92.0％和104.4％。 2.花色苷對(duì)HepG2細(xì)胞脂肪酸氧化的影響與對(duì)照組相比，100μM Cy-3-g和1mM AICA

14、R能顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞脂肪酸氧化(p<0.01)，脂肪酸氧化水平為對(duì)照組的1.2倍，與AMPK激動(dòng)劑1mMAICAR處理組相當(dāng)。 3.花色苷對(duì)HepG2細(xì)胞CPT-I蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能顯著促進(jìn)CPT-I蛋白的表達(dá)水平(p<0.001)，CPT-I蛋白表達(dá)水平分別為對(duì)照組的1.7倍、3.7倍和4.2倍，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比，相當(dāng)于1mM A

15、ICAR處理組的43.6％、92.096和104.4％。 4.花色苷對(duì)HepG2細(xì)胞ACC磷酸化的影響與對(duì)照組相比，10gM、100pM Cy-3-g能顯著促進(jìn)ACC的磷酸化(p<0.001)，ACC磷酸化分別為對(duì)照組的3.1倍和4.2倍，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比，相當(dāng)于1mM AICAR處理組的57.9％和77.7％。 5.花色苷對(duì)HepG2細(xì)胞AMPK活化的影響與對(duì)照組相比，1μM、10

16、μM、100μM Cy-3-g能顯著促進(jìn)AMPK的活性(p<0.001)，AMPK蛋白活性分別為對(duì)照組的1.4倍、3.6倍和5.4倍，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比，相當(dāng)于1mMAICAR處理組的25.1％、64.4％和97.1％。 6.花色苷對(duì)HepG2細(xì)胞AMPK磷酸化的影響與對(duì)照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g能使顯著促進(jìn)AMPK蛋白磷酸化(p<0.001)，AMPK蛋白磷酸化水平

17、分別為對(duì)照組的1.4倍、2.0倍和3.0倍，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與AMPK激動(dòng)劑AICAR相比，相當(dāng)于1mMAICAR處理組的49.4％、69.5％和103.6％。 7.花色苷對(duì)HepG2細(xì)胞AMPK蛋白的影響與對(duì)照組相比，1μM、10μM、100μM Cy-3-g和1mM AICAR對(duì)AMPK蛋白表達(dá)水平無(wú)影響(p>0.05)。 結(jié)論： 1.花色苷Cy-3-g可以減少HepG2細(xì)胞脂肪積聚； 2.花