黃綠青霉素通過(guò)ROS介導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬性死亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:黃綠青霉素(citreoviridin，CIT)是由發(fā)霉谷物產(chǎn)生出的次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如玉米、大米等。研究發(fā)現(xiàn)黃綠青霉素在大米中生長(zhǎng)速度最快，產(chǎn)毒數(shù)量最高。很多大米消費(fèi)水平高的發(fā)展中國(guó)家由于溫度較高、氣候潮濕等儲(chǔ)物條件有利于真菌的生長(zhǎng)和毒素的產(chǎn)生，因此在這些國(guó)家黃綠青霉素污染較嚴(yán)重，成為一個(gè)不可忽視的重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。黃綠青霉素已經(jīng)被證實(shí)與多種疾病有關(guān)。肝臟是解毒的重要器官也是很多真菌毒素的靶器官。動(dòng)物攝入的黃綠青霉素主要集中于中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟和心臟。黃綠青霉素肝臟毒性的分子機(jī)制尚未完全明確。細(xì)胞自噬是近些年來(lái)的研究熱點(diǎn)，自噬是指細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)包裹于雙層或多層膜結(jié)構(gòu)，形成自噬小體，而自噬小體與溶酶體融合并對(duì)其內(nèi)容物進(jìn)行消化的過(guò)程。正常水平的自噬是一種通過(guò)降解胞內(nèi)異常組分以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，然而自噬水平過(guò)度上調(diào)則引起細(xì)胞自噬性死亡。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯奎S綠青霉素是否改變了細(xì)胞自噬的過(guò)程及自噬在黃綠青霉素肝臟毒性中所發(fā)揮的作用，是保護(hù)肝臟細(xì)胞

3、還是促進(jìn)肝臟細(xì)胞的死亡。本研究可以進(jìn)一步加深對(duì)黃綠青霉素肝臟毒性分子機(jī)制的理解。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)以HepG2細(xì)胞作為研究對(duì)象。用MTT（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法）檢測(cè)不同劑量黃綠青霉素處理后的HepG2細(xì)胞存活率的變化;預(yù)先使用不同試劑（自噬抑制劑3-MA、自噬激活劑雷帕霉素、siRNA Atg5、活性氧抑制劑NAC）處理后，用黃綠青霉素處理HepG2細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞存活率的變化;用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;用透射電子顯

4、微鏡觀察細(xì)胞自噬小體的超微結(jié)構(gòu);用熒光顯微鏡觀察經(jīng)Cyto-ID(R)Green染色的自噬小體熒光強(qiáng)弱的變化;用Western blot（蛋白質(zhì)免疫印跡法）檢測(cè)黃綠青霉素處理的LC3（細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)記物-微管相關(guān)蛋白輕鏈3）和P62蛋白表達(dá)量的變化;用LC3-turnover實(shí)驗(yàn)鑒別細(xì)胞內(nèi)聚集的自噬小體是由自噬小體增多所致，還是由自噬小體降解障礙所致;用DCFH-DA（2'，7'-二氫二氯熒光素）檢測(cè)不同劑量黃綠青霉素處理的細(xì)胞內(nèi)ROS的

5、含量變化。
　　結(jié)果:經(jīng)過(guò)不同濃度黃綠青霉素(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM)染毒24小時(shí)后，隨著CIT濃度的增加HepG2細(xì)胞存活率明顯下降;用自噬抑制劑3-MA(3-Methyladenine)、ROS（Reactive oxygen species，活性氧）抑制劑NAC(N-乙酰半胱氨酸)和siRNA Atg5干預(yù)后，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比明顯增高;用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理4小時(shí)，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比明顯下降。

6、用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化可進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)論。電子顯微鏡下可明顯觀察到自噬小體的雙層或多層膜結(jié)構(gòu)，且自噬小體數(shù)量增加。熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)的自噬小體隨著黃綠青霉素劑量升高而逐漸增多。LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)隨黃綠青霉素濃度增加而增加，P62蛋白表達(dá)隨黃綠青霉素濃度增加而減少;在LC3-turnover實(shí)驗(yàn)中，用自噬小體與溶酶體融合的抑制劑Cq（chloroquine，氯喹）處理后，與對(duì)照組相比LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量明顯增多，這說(shuō)明聚集

7、的自噬小體是由自噬小體生成增多所致，而不是由自噬小體降解障礙引起;用活性氧ROS抑制劑NAC預(yù)處理1小時(shí)后，與對(duì)照組相比LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量明顯減少。細(xì)胞內(nèi)活性氧水平隨黃綠青霉素劑量的升高而升高;用ROS抑制劑NAC預(yù)處理HepG2細(xì)胞可有效降低活性氧水平，并可以逆轉(zhuǎn)黃綠青霉素的細(xì)胞毒性。
　　結(jié)論:黃綠青霉素可在HepG2細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)自噬小體的形成。在黃綠青霉素的肝臟毒性中，細(xì)胞自噬是細(xì)胞死亡的主要原因，而黃綠青霉素誘導(dǎo)的自噬性細(xì)