二苯乙烯苷對肝癌HepG2細胞膽固醇外流的影響.pdf

1、目的：
　　何首烏的主要化學成分有總苷、多糖及蒽醌類化合物等，其中以總苷類成分中的二苯乙烯苷最為多見。本實驗通過觀察二苯乙烯苷對肝癌HepG2細胞膽固醇含量的變化，以及細胞內(nèi)膽固醇相關蛋白及基因的表達情況，闡明該化合物降低膽固醇水平的作用是通過加快膽固醇外流而發(fā)揮作用的，從而初步探討二苯乙烯苷抗動脈粥樣硬化的作用機制，為何首烏抗高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的研究提供依據(jù)。
　　方法：

2、r>　　1.肝癌HepG2細胞采用的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清、1％雙抗及高糖型DMEM。靜置于37℃，5％CO2飽和濕度條件下孵育箱中培養(yǎng);
　　2.制作高膽固醇細胞模型，采用不同濃度的ox-LDL(0mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L)處理細胞不同時間(24h、48h、72h)對細胞內(nèi)膽固醇含量的影響，通過膽固醇氧化酶法測定膽固醇含量及油紅O染色觀察，優(yōu)選最佳藥物濃度及作用時間;
　　3.

3、MTT法檢測不同濃度二苯乙烯苷(0、62.5、125、188、250、500、600、700、800、900、1000μmol/L)作用不同時間(24h、48h)對肝癌HepG2細胞的細胞毒性影響，確定體外細胞給藥濃度水平及作用時間，以闡明二苯乙烯苷對肝癌HepG2細胞膽固醇外流的影響;
　　4.二苯乙烯苷在高膽固醇狀態(tài)下對肝癌HepG2細胞內(nèi)膽固醇代謝的影響，用不同濃度二苯乙烯苷（0、62.5、125、188、250μmol/L

4、）處理細胞48h后，通過膽固醇氧化酶法測定上清、裂解細胞膽固醇含量，檢測二苯乙烯苷是否能夠通過加快細胞膽固醇外流這一途徑來降低細胞內(nèi)膽固醇的含量;
　　5.RT-PCR法檢測二苯乙烯苷對肝癌HepG2細胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1（ATP-binding cassette transporterG1，ABCG1）、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)以及B族Ⅰ型清

5、道夫受體（scavenger reptor class BtypeⅠ，SR-BⅠ）基因相對表達量的影響;
　　6.蛋白印跡法(Western Blot)檢測二苯乙烯苷對肝癌HepG2細胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette transporterA1，ABCA1)蛋白表達量的影響。
　　結(jié)果：
　　1.制作高膽固醇模型，經(jīng)油紅O染色后，細胞體積增大變圓，胞漿內(nèi)有許多的脂滴存在，胞漿疏松化;膽

6、固醇氧化酶法測定結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組細胞內(nèi)總膽固醇(total cholesterol，TC)和游離膽固醇(free cholesterol，F(xiàn)C)含量均明顯增加(P＜0.05)，同時，可以看出ox-LDL在50mg/L作用細胞48h時，細胞內(nèi)膽固醇含量最高，與油紅O結(jié)果一致。可用于后續(xù)實驗。
　　2.MTT結(jié)果顯示二苯乙烯苷在62.5μmol/L～250μmol/L濃度范圍內(nèi)對肝癌HepG2細胞均未產(chǎn)生顯著影響，表

7、明其對細胞無明顯毒性作用，藥物作用48h時效果最好，可在后續(xù)實驗中采用。
　　3.在高膽固醇狀態(tài)下，加用不同濃度二苯乙烯苷(0、62.5、125、188、250μmol/L)干預細胞48h后，研究顯示，與模型組相比，藥物組裂解細胞內(nèi)TC、FC含量均有所降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);同時藥物組上清TC、FC含量顯著升高(P＜0.05)。二苯乙烯苷能夠明顯減少高膽固醇細胞內(nèi)膽固醇含量，增加膽固醇外排率，其中二苯乙烯苷濃度為

8、125μmol/L時達到最高值，表明二苯乙烯苷對HepG2高膽固醇細胞有明顯抑制作用。
　　4.RT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度的二苯乙烯苷作用細胞48h后，與模型組相比，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1(ABCG1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)及清道夫受體(SR-BⅠ)的基因表達有明顯升高趨勢，其中ABCG1和ABCA1在二苯乙烯苷濃度為250μmol/L時達到最高值;SR-BⅠ在二苯乙烯苷濃度為188μmol/L時達到最高值，差

9、異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.Western Blot結(jié)果顯示，不同濃度的二苯乙烯苷作用細胞48h后，與模型組相比，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ATP-binding cassette transporterA1，ABCA1）蛋白表達有明顯升高趨勢，其中二苯乙烯苷濃度在188μmol/L時達到最高值，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　二苯乙烯苷能夠促進肝癌HepG2細胞膽固醇的外流，其機制