二苯乙烯苷對支氣管上皮細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的影響及機(jī)理研究.pdf

1、缺氧/復(fù)氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)及氧化應(yīng)激損傷頻繁發(fā)生于人體各組織，尤其是在呼吸系統(tǒng)，因?yàn)榉魏椭夤苤苯优c外環(huán)境相通并且隨時(shí)進(jìn)行著氣體交換。大量研究證實(shí)H/R通常造成活性氧簇（oxygen species，ROS）生成增加，進(jìn)而始動(dòng)不可控的氧化應(yīng)激損傷和隨后的細(xì)胞凋亡。這些改變伴隨著細(xì)胞器的失活和多種疾病的發(fā)生。另一方面，隨著大氣污染加劇，環(huán)境因素在氣道炎癥性疾病病理機(jī)制中的作用日益受到關(guān)注。許多肺部炎癥

2、，如慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘、肺癌、肺氣腫等很大程度上以反復(fù)發(fā)作、病程長為特點(diǎn)。由于通氣受限，這些疾病伴隨乃至加重了長期、反復(fù)的缺氧/復(fù)氧損傷和氧化應(yīng)激狀態(tài)。因此，以抗氣道炎癥、抗氧化應(yīng)激損傷為主的呼吸系統(tǒng)藥物研發(fā)顯得尤為重要。
　　支氣管上皮細(xì)胞是呼吸道抵御外界刺激的第一道防線，大氣污染物、吸煙、機(jī)械性損傷等都可造成支氣管上皮細(xì)胞損傷。支氣管上皮細(xì)胞也是遭受H/R損傷的主要部位。氧化應(yīng)激損傷持續(xù)存在，導(dǎo)致支氣管、肺組織損傷修復(fù)

3、受損，上皮細(xì)胞凋亡、脫落，黏液分泌增加，釋放多種炎性因子，加重炎癥反應(yīng)。
　　在本論文的第一部分，利用建立的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(Nitric Oxide，NO)模型，考察TSG在1.25μM至640μM濃度下對LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞生成NO的作用，其IC50=1.20×10-4 M。但對于TNF-α、IL-6和IL-1β的生成影響沒有觀察到顯著性差異。提示TS

4、G具有一定的抗炎活性，但需進(jìn)一步觀察和系統(tǒng)評價(jià)，并且根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TSG可能具有較好的抗氧化應(yīng)激損傷活性。故進(jìn)一步通過建立H/R體外損傷模型，對人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)進(jìn)行了TSG抗缺氧/復(fù)氧損傷活性觀察。結(jié)果顯示，H/R處理后，BEAS-2B細(xì)胞增殖受到抑制，而TSG的預(yù)處理可以顯著提高H/R損傷后的BEAS-2B細(xì)胞的存活率，并且具有較小的細(xì)胞毒性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察到，在12.5μM的濃度下TSG可顯著抑制細(xì)胞活性氧簇(re

5、activeoxygen species，ROS)的生成，同時(shí)還可以抑制丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的生成，而超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性沒有顯著性影響。
　　在本論文的第二部分，對TSG抗氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。在前部分結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)表明，TSG能抑制H/R誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B的凋亡。
　　以GFP-Bax穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人乳

6、腺癌細(xì)胞株MCF-7/GFP-Bax為工具，觀察TSG抑制細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax向線粒體轉(zhuǎn)位和抑制核損傷的活性。Hoechst33258染色結(jié)果顯示，TSG（50.0μM、100μM）能明顯抑制H/R誘導(dǎo)的MCF-7/GFP-Bax細(xì)胞核固縮和碎片化等損傷。熒光顯微鏡下觀察到，TSG(25.0μM、50.0μM、100μM)抑制Bax向線粒體的轉(zhuǎn)移定位。在BEAS-2B細(xì)胞上通過Western Blot法觀察到了同樣TSG抑制Bax向線

7、粒體轉(zhuǎn)位的活性。在H/R誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞中，TSG可抑制線粒體膜電位下降、細(xì)胞色素C釋放以及caspase-9、caspase-3活化。
　　絲裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)在介導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激刺激和下游細(xì)胞應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。在H/R發(fā)生之時(shí)，氧化應(yīng)激激活MAPK介導(dǎo)細(xì)胞存活或凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。家族內(nèi)的p38 MAPK和SAPK/JNK1/2由炎性細(xì)胞因

8、子和環(huán)境應(yīng)激因素激活，發(fā)揮促凋亡作用，ERK1/2則由生長因子及細(xì)胞因子激活，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。通過Western Blot觀察了TSG對MAPK信號通路的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，TSG可顯著降低了p38和JNK1/2在H/R處理的BEAS-2B細(xì)胞中的磷酸化蛋白質(zhì)/總蛋白比，并存在一定的劑量依賴性。另一方面，還觀察到了TSG還可以通過降低缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor1，HIF-1)的表達(dá)，降低核蛋

9、白p53的磷酸化激活，協(xié)同發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。
　　概括來說，本論文分兩部分，一部分主要建立了LPS誘導(dǎo)的體外炎癥模型和體外H/R損傷模型、觀察化合物TSG對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞抗炎和對支氣管上皮細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的活性，另一部分主要關(guān)注H/R誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑、探討TSG對H/R誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用的機(jī)制，為防治支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病、肺氣腫等呼吸道疾病新型藥物研發(fā)和缺血-再灌注損傷保護(hù)提供了研究思路和