甲苯二異氰酸鹽對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞活性氧生成及通透性的影響.pdf

1、支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種嚴(yán)重威脅人們健康的慢性呼吸道疾病,以氣道非特異性炎癥、氣道反應(yīng)性增高及氣道重塑為主要特征。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì),全世界約有哮喘病人3億,而我國目前約有2700萬哮喘患者,而且患病率有逐漸上升的趨勢(shì)。
　　 目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為應(yīng)把引起哮喘的諸多環(huán)境因素分為致病因素(Trigger)和誘發(fā)因素(Contributot)兩大類。致病因素是指引起哮喘首次發(fā)作的因素,是哮喘發(fā)病的“扳機(jī)”和主要病因,無論在哮喘的發(fā)生和發(fā)展中

2、均起重要作用；誘發(fā)因素是指病人在已患有哮喘的基礎(chǔ)上誘發(fā)隱性哮喘重新活動(dòng)或哮喘急性發(fā)作的因素,是哮喘發(fā)作過程中的綜合誘發(fā)因素之一,在促使哮喘病情復(fù)發(fā)和進(jìn)一步發(fā)展中起重要作用。在上述兩大類因素中,某些因素如變應(yīng)原、刺激性氣體和有害氣體、職業(yè)性因素、病毒、食物和藥物等兼有上述雙重作用,既可導(dǎo)致哮喘的發(fā)生,又可在哮喘病情的發(fā)展過程中起重要作用。然而,我們應(yīng)當(dāng)明確所有的環(huán)境因素并非是決定哮喘是否發(fā)生的唯一因素,哮喘患者本身的特應(yīng)性體質(zhì)也是非常重要

3、的?；颊邆€(gè)體的過敏體質(zhì)及外界環(huán)境的雙重影響是導(dǎo)致哮喘發(fā)病的綜合危險(xiǎn)因素。
　　 目前,很多環(huán)境因素參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展,其中,在工業(yè)環(huán)境里受到廣泛關(guān)注的是甲苯二異氰酸鹽(Toluene Diisocyanate,TDI)。TDI的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是帶有活性很高的N=C=O基團(tuán),使其成為一種反應(yīng)活性很強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì),主要用于生產(chǎn)軟質(zhì)聚氨酯泡沫及聚氨酯彈性體、涂料、膠黏劑等,在家居和建筑等日常各種室內(nèi)外裝修中主要存在于油漆之中。據(jù)統(tǒng)計(jì),異氰酸

4、鹽是引起職業(yè)性哮喘最常見的原因,且誘發(fā)的哮喘經(jīng)常發(fā)展為重癥哮喘,其患病率與工業(yè)發(fā)達(dá)程度密切相關(guān)。由于成本相對(duì)較低,在工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的就是TDI,據(jù)統(tǒng)計(jì),長(zhǎng)期暴露于TDI環(huán)境的人群,約有5％～15％發(fā)展為哮喘,而全球普通人群的哮喘患病率約為0.1%～8％,我國約為0.11%～2.03％,隨著我國工業(yè)的發(fā)展,像TDI哮喘這樣一些職業(yè)性哮喘的患病率也在逐年增加,其發(fā)病率之高須受到高度重視。從表現(xiàn)形式看,TDI哮喘的臨床表現(xiàn)和病理變化與過敏性

5、哮喘大致相同,但目前針對(duì)TDI哮喘的發(fā)病機(jī)制研究并不多,相關(guān)研究領(lǐng)域還比較局限,許多方面還不是很清楚。目前相關(guān)的研究提示TDI引起人體致敏并最終激發(fā)為哮喘包括兩個(gè)主要環(huán)節(jié):一是人們呼吸系統(tǒng)的支氣管上皮細(xì)胞(HBE)作為直接接觸TDI的主要靶細(xì)胞,在日常工業(yè)環(huán)境中經(jīng)常受到低濃度的TDI刺激,當(dāng)長(zhǎng)期受到TDI刺激后,可能逐漸出現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變和功能的紊亂,并導(dǎo)致一系列生物活性分子的產(chǎn)生與釋放,是TDI誘發(fā)哮喘的基礎(chǔ),在其發(fā)病機(jī)理中扮演重要角

6、色；二是TDI所含的異氰基團(tuán)與體內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合后,生成大分子異性蛋白如TDI-人血清白蛋白(TDI-HSA),成為完全抗原物質(zhì),可能通過某些中間環(huán)節(jié)滲透到粘膜下組織,然后被抗原提呈細(xì)胞提呈后進(jìn)一步誘發(fā)其產(chǎn)生一系列活性物質(zhì)、細(xì)胞因子,這些活性分子與上述HBE所產(chǎn)生的生物活性因子一起協(xié)同活化中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(包括Th1和Th2)、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞,進(jìn)而導(dǎo)致下游一系列與過敏性哮喘相似的炎癥變態(tài)反應(yīng)。我們可簡(jiǎn)單把上述兩個(gè)

7、機(jī)制概括為啟動(dòng)與維持,因此,對(duì)TDI哮喘發(fā)病機(jī)制尤其是啟動(dòng)與維持機(jī)制的深入剖析,可能為TDI哮喘的防治提供新的理論依據(jù)和作用靶點(diǎn),這是對(duì)TDI哮喘能夠達(dá)到有效的診斷和治療的關(guān)鍵步驟。
　　 我們知道,氧化應(yīng)激與哮喘的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān),涉及到哮喘的自然病史、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、組織損傷、氣道血管通透性增加及氣道重塑等。盡管如此,有關(guān)氧化應(yīng)激在哮喘的致病作用及機(jī)制的研究進(jìn)展緩慢。另外,HBE具有復(fù)雜的屏障功能,作為防御吸入有害

8、物質(zhì)及病原微生物的第一道防線。目前認(rèn)為,其結(jié)構(gòu)完整性缺陷和功能紊亂是哮喘的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。哮喘病人的HBE經(jīng)常處于內(nèi)源性和外源性氧化應(yīng)激環(huán)境當(dāng)中,當(dāng)HBE遭遇過度氧化應(yīng)激并出現(xiàn)抗氧化功能紊亂時(shí),這種平衡將被打破,從而引起固有免疫系統(tǒng)及獲得性免疫系統(tǒng)的相繼活化。這充分提示HBE氧化抗氧化失衡在哮喘發(fā)病中的重要作用。
　　 有實(shí)驗(yàn)表明:應(yīng)用TDI刺激HBE可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽GSH的含量下降,顯著改變了細(xì)胞的氧化還原平衡狀態(tài)。通過

9、抗氧化劑維生素C和維生素E的干預(yù),能夠減輕經(jīng)TDI滴鼻豚鼠的氣道炎癥和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。這提示,氧化應(yīng)激在TDI致病中發(fā)揮重要作用。另外,本課題組前期體外研究已證明:應(yīng)用TDI-HSA在不影響細(xì)胞活力的情況下,可顯著增加正常人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)的通透性。雖然,目前關(guān)于氧化應(yīng)激與氣道上皮通透性關(guān)系的研究并不多,但有證據(jù)表明:氧化應(yīng)激可以明顯增加腸上皮通透性。因此,我們有理由推測(cè):TDI也可能通過氧化應(yīng)激環(huán)節(jié)來增加氣道上皮通透性,

10、從而滲透到粘膜下組織參與其后續(xù)的病理調(diào)節(jié)過程。
　　 為此,本研究即在前期建立的TDI刺激HBE的體外研究模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步以活性氧(ROS)為主要觀察指標(biāo),探討氧化應(yīng)激對(duì)氣道上皮通透性的介導(dǎo)作用,試圖為研究TDI哮喘的發(fā)病機(jī)制提供一些理論依據(jù)。
　　 課題第一部分:甲苯二異氰酸鹽對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞活性氧生成的影響
　　 方法:
　　 1、制備TDI抗原結(jié)合物:應(yīng)用改良的Son M方法制備TDI-人血清

11、白蛋白(TDI-HSA)。
　　 2、四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度的TDI-HSA對(duì)正常人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE細(xì)胞活力的影響。分組情況:對(duì)照組(不加TDI-HSA只以無血清培養(yǎng)基孵育),10 ug/ml TDI-HSA組,20ug/ml TDI-HSA組,40 ug/ml TDI-HSA組,60 ug/ml TDI-HSA組,80 ug/ml TDI-HSA組,100 ug/ml TDI-HSA組,120 ug/ml

12、 TDI-HSA組,150 ug/ml TDI-HSA組(n=7)。按上述分組刺激16HBE48h后,用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力。
　　 3、觀察不同濃度TDI—HSA對(duì)16HBE ROS生成的影響。分組情況:對(duì)照組(不加TDI-HSA只以無血清培養(yǎng)基孵育),20 ug/ml TDI—HSA組,60 ug/mlTDI-HSA組,100ug/ml TDI-HSA組(n=3)。按上述分組刺激16HBE24h后,胰酶消化并收集細(xì)胞,通

13、過2',7'-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)細(xì)胞內(nèi)ROS熒光染色,以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。
　　 4、四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)不同濃度的N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)正常人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE細(xì)胞活力的影響。分組情況:正常對(duì)照組,10mmol/LNAC組,20 mmol/LNAC組,50 mmol/LNAC組,80 mmol/L NAC組(n=6)。按上述分組刺激16HBE12 h后,用MTT比色法檢測(cè)細(xì)

14、胞活力。
　　 5、觀察NAC作用下TDI-HSA對(duì)16HBE ROS生成的影響。選取對(duì)ROS升高最明顯的TDI-HSA濃度100 ug/ml,預(yù)先加入抗氧化劑NAC處理40 min,濃度為50 mmol/L,預(yù)處理時(shí)間結(jié)束后吸去含NAC的培養(yǎng)液,用無血清培養(yǎng)液輕輕漂洗細(xì)胞2次以除去殘留的NAC,加入TDI—HSA,上述刺激24h后收集細(xì)胞,通過2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)細(xì)胞內(nèi)ROS熒光染色,以熒光顯微

15、鏡觀察照相,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用Welch法,各組間多重比較采用Dunnett’s T3法檢驗(yàn)。以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、不同TDI—HSA濃度組對(duì)

16、16HBE細(xì)胞活力的影響:TDI—HSA濃度為10 ug/ml、20 ug/ml、40 ug/ml、60 ug/ml、80 ug/ml、100 ug/ml、120 ug/ml對(duì)16HBE活力均沒有顯著影響,濃度為150 ug/ml時(shí)顯著降低細(xì)胞活力(P<0.05)。
　　 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度TDI-HSA對(duì)16HBE ROS生成的影響:20 ug/ml組、60 ug/ml組、100 ug/ml組與對(duì)照組相比,ROS的絕對(duì)

17、熒光值顯著增加(P<0.05),且隨著TDI-HSA濃度的提高ROS的生成亦隨之增加。
　　 3、不同NAC濃度組對(duì)16HBE細(xì)胞活力的影響:NAC在50 mmol/L濃度以內(nèi)時(shí)與對(duì)照組相比對(duì)細(xì)胞活力均沒有顯著影響,濃度為80 mmol/L時(shí)顯著降低細(xì)胞活力(P<0.001)。
　　 4、熒光顯微鏡觀察照相、流式細(xì)胞儀檢測(cè)NAC對(duì)TDI-HSA誘導(dǎo)16HBE ROS生成的影響:
　　 與對(duì)照組相比,100 ug/

18、ml TDI-HSA組ROS的絕對(duì)熒光值顯著增加,兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),NAC+100 ug/ml TDI—HSA組與100 ug/mlTDI-HSA組相比ROS的絕對(duì)熒光值顯著減少,兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光十分微弱,經(jīng)100 ug/ml TDI—HSA處理24h后熒光明顯增強(qiáng),綠色熒光彌漫著染胞質(zhì),通過NAC預(yù)處理的熒光明顯減弱。
　　 結(jié)論:
　　 TD

19、I-HSA在不影響細(xì)胞活力的情況下,呈濃度依賴性上調(diào)16HBE ROS的生成,其中以100 ug/ml濃度對(duì)ROS的影響最大,且該效應(yīng)大部分被NAC預(yù)處理干預(yù)所抑制。
　　 課題第二部分:甲苯二異氰酸鹽對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞通透性的影響及機(jī)制探討
　　 方法:
　　 1、分組:對(duì)照組(不加TDI—HSA只以無血清培養(yǎng)基孵育),100 ug/ml TDI-HSA組,50mmol/LNAC+100 ug/ml TDI—H

20、SA組(n=4)。按上述分組刺激16HBE24h后,用跨上皮細(xì)胞電阻測(cè)定儀測(cè)定細(xì)胞間電阻值TEER,以反映細(xì)胞間通透性大小。
　　 2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用Welch法,各組間多重比較采用Dunnett's T3法檢驗(yàn)。以P<0.05

21、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 跨上皮細(xì)胞電阻測(cè)定儀檢測(cè)TDI-HSA對(duì)16HBE細(xì)胞間通透性的影響及ROS氧化應(yīng)激通路在其中的介導(dǎo)作用:TEER在TDI-HSA組與對(duì)照組比較顯著減少(P<0.001),在NAC+TDI-HSA組與TDI-HSA組比較顯著增加(P<0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 TDI-HSA明顯增加16HBE間的通透性,加入抗氧化劑NAC預(yù)處理可大部分逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。TDI-HS