版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、背景:
心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段,具有較高的發(fā)病率和死亡率。近年來各種藥物治療使心力衰竭患者的生活質(zhì)量大大提高,但其生存率仍無明顯改善。究其原因,主要是其發(fā)病機制還不十分清楚。自噬是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的降解途徑,細胞通過單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬小體,然后運送到溶酶體形成自噬溶酶體并進行多種酶的消化及降解,以實現(xiàn)細胞自身的代謝和細胞器的更新,自噬對維持細胞的自身穩(wěn)態(tài)具有重要意義。最近
2、的研究表明自噬在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。因此闡明自噬在心衰中的確切作用,有助于進一步了解心衰的發(fā)病機制,為心衰的有效防治提供新的思路和策略。然而,目前自噬在心衰中的具體作用尚不明了,自噬在心衰中的時序性表達變化和對心肌的產(chǎn)生有利或有害作用值得進一步探討。
目的:
建立小鼠主動脈弓縮窄(Transverseaorticarchconstriction,TAC)模型,觀察TAC小鼠心衰進展過程
3、中自噬功能的時序性變化,并探討心衰過程中自噬功能紊亂的可能機制。
實驗Ⅰ:
方法:
1.實驗分組
170只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常組(50只),假手術組(50只)和心衰組(70只)。各組分別于0天、3天、7天、14天、28天處死8-11只小鼠。
2.動物模型的建立
小鼠腹腔注射0.08%戊巴比妥鈉麻醉、固定后,在大體顯微鏡下行TAC術。在頸部中
4、心位置作一縱行10mm切口,鈍性分離左、右頸總動脈,于雙側(cè)頸總動脈分支處盲穿并結扎主動脈弓,27號針頭與主動脈弓一同結扎后,抽出針頭,以控制主動脈弓狹窄率(60±5%)。假手術組的手術步驟同上,但不結扎主動脈弓。
3.存活率分析
保留存活記錄并繪制曲線圖。
4.超聲心動圖檢測
所有小鼠于處死前行經(jīng)胸壁超聲心動圖檢測,計算左室射血分數(shù)(Ejectionfraction,EF%)、左室
5、重量(Leftventricularmassweight,LVMW)。
5.組織病理學及免疫組織化學染色檢查
留取小鼠心臟標本,行蘇木素-伊紅染色(Haematoxylineosin,HE)、Masson染色,觀察心臟大體形態(tài)學改變;行免疫組織化學染色檢測心肌內(nèi)各指標的表達:
(1)自噬指標:微管相關蛋白1輕鏈3(Microtubule-associateprotein1lightchain3,
6、LC3)、Bcl-2相互作用蛋白(Bcl-2interactingcoiled-coilprotein-1,Beclin-1)、Beclin-1相互作用蛋白(RUNdomainproteinasBeclin1-interactingandcysteine-richcontaining,Rubicon)、P62(Sequestosome1/SQSTM1);
(2)炎癥指標:單核細胞趨化蛋白-1(Monocytechemoat
7、tractantprotein-1,MCP-1)、細胞間粘附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)、Toll樣受體4(Toll-likereceptor4,TLR4)、髓樣分化因子88(Myeloiddifferentiationfactor88,Myd88)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(Tissuein
8、hibitorofmatrixmetalloprotease-1,TIMP-1);
(3)氧化應激指標:4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)、8-羥基-2'-脫氧鳥苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8OHdG)。
6.實時定量聚合酶鏈反應(Real-timequantitativepolymerasechainreaction,Real-timePCR):檢
9、測心肌內(nèi)LC3a、LC3b、自噬相關基因(Autophagy-relatedgene,Atg)Atg5、Atg7、Rubicon、Beclin-1的表達。
7.統(tǒng)計學分析
統(tǒng)計學處理計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,所有數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組數(shù)據(jù)間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間均數(shù)比較采用包含Bonferronipost-hoc檢驗的單因素或雙因素方差分析。多組間的兩兩比較采
10、用費希爾的LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
結果:
1.實驗動物的一般情況
本研究共120只小鼠進行了手術,50只為假手術組,只掛線不結扎主動脈弓,1只死于麻醉意外,其余全部存活;70只為心衰組,TAC手術當天存活小鼠56只,手術成功率為80%。
2.心臟超聲學檢測結果
心臟超聲圖像顯示術后28天心衰組小鼠左心室室壁變薄,心腔明顯擴大,心肌收縮力減退。與正常
11、組和假手術組相比,心衰組小鼠術后EF%明顯下降,術后第3天由術前的73.4±3.5%降至41±10.4%(P<0.01);術后7天至28天EF%下降較緩慢,術后28天小鼠EF%為36.2±5.7%(P<0.01)。心衰組小鼠術后LVMW較正常組和假手術組顯著增高(P<0.05),術后3天LVMW由42.2±10.2增至52.5±12.7,術后28天增至58.2±11.0。
3.病理學檢測
(1)病理學染色
12、r> HE染色和Masson染色均顯示隨著心衰時間的延長,心衰組小鼠心肌細胞直徑增大,心臟橫徑和左心室腔不斷增大。術后28天心肌纖維化明顯,與正常組和假手術組比較具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。
(2)自噬因子表達變化
與正常組和假手術組相比,心衰組小鼠心肌LC3表達明顯增高,呈雙峰分布,在3天和7天表達持續(xù)升高,在7天達到第一個峰值(P<0.01);在14天略有降低(P<0.05或P<0
13、.01);在28天表達明顯增強,達到第二個峰值(P<0.01)。與正常組和假手術組相比,心衰組小鼠心肌Beclin-1表達在術后3天和7天,明顯升高(P<0.01)。
與正常組和假手術組相比,心衰組小鼠心肌P62表達在7天和28天顯著升高(P<0.05或P<0.01)。
與正常組和假手術組相,心衰組小鼠心肌Rubicon的表達在術后3天、7天、14天、28天均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。
14、 (3)炎癥因子表達變化
與正常組和假手術組相比,心衰組小鼠心肌MCP-1表達明顯升高,呈雙峰分布,在3天表達較高(P<0.01),在7天表達略有減低(P<0.05或P<0.01),在14天和28天又持續(xù)升高(P<0.01)。
與正常組和假手術組相比,心衰組小鼠心肌ICAM-1表達在各時間點均顯著升高,在7天、28天表達較高(P<0.01),3天、14天表達略低(P<0.05)。與正常組和假手術組相比,心
15、衰組小鼠心肌MMP-9表達在14天、28天表達略有升高(P<0.05)。
與正常組和假手術組相比,心衰組TIMP-1表達在28天顯著升高(P<0.05或P<0.01),余無顯著性差異。
與正常組和假手術組相比,心衰組TLR4表達在各時間點均顯著升高,并隨時間不斷增強,與正常組和假手術組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。
與正常組和假手術組相比,心衰組小鼠Myd88表達在14天
16、顯著升高(P<0.05),余無顯著性差異。
(4)氧化應激因子表達變化
心衰組小鼠心肌80HdG的表達明顯增強,術后3天陽性率為24.18±6.63%,較假手術組(10.40±4.54%)和正常組(3.13±1.33%)顯著增強(P<0.05或P<0.01);術后7天略下降至11.58±3.05%;術后14天、28天又持續(xù)上升(分別為28.56±7.31%,P<0.05;30.79±7.47%,P<0.01)
17、。心衰組小鼠心肌4-HNE表達也顯著增強,在術后3天升高至正常組的6-7倍,7天略下降至3-4倍,14天、28天又升高至4-6倍,與正常組和假手術組比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
4.Real-timePCR結果
與正常組和假手術組比較,心衰組小鼠心肌LC3amRNA的水平隨時間呈單峰分布,在7天達到最高(P<0.01),余時間點無顯著性差異;
與正常組和假手術組比較,心衰組LC3b的mR
18、NA表達水平也呈單峰分布,在3天、7天表達最高(P<0.05),28天恢復到正常水平;
與正常組和假手術組比較,心衰組小鼠心肌Atg5mRNA表達水平在3天、7天、14天明顯增高(P<0.01),在28天基本降至基礎水平;
與正常組和假手術組比較,心衰組小鼠心肌Atg7mRNA表達水平在3天明顯升高(P<0.01),達到高峰,在28天基本降至基礎水平,余時間點差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
19、與正常組和假手術組比較,心衰組小鼠心肌Beclin-1mRNA表達水平表現(xiàn)為在第3天顯著升高(P<0.01),在7天、14天迅速降至基礎水平,在28天略有升高,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
與正常組和假手術組比較,心衰組小鼠心肌Rubicon的mRNA表達水平隨時間呈雙峰分布,在7天、28天達到最高值(P<0.01),14天略有降低(P<0.05)。
實驗Ⅱ:
方法:
1.實驗
20、動物
180只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常組(50只),假手術組(50只)和心衰組(80只)。以上各組組內(nèi)又隨機分為3個亞組:雷帕霉素組、雷帕霉素加氯喹組和生理鹽水組,共9個亞組。各亞組分別于TAC術后7天、28天處死8-10只小鼠,小鼠處死前4h分別給予腹腔注射雷帕霉素(30mg/kg)或(和)氯喹(2mg/kg)或生理鹽水(0.2ml)。
2.動物模型的建立
動物模型的建立方法同實驗Ⅰ
21、。
3.病理學檢測
LC3免疫組化檢測各組心肌LC3的蛋白表達水平。
4.Real-timePCR檢測
檢測各組LC3a、LC3b的mRNA表達水平。
結果:
1.病理學染色
在不應用雷帕霉素和氯喹干預情況下,術后7天心衰組小鼠心肌LC3表達陽性率為21.43±2.9%,術后28天達28.20±3.24%,與正常組和假手術組比較均具有顯著性
22、差異(P<0.01)。
術后7天,雷帕霉素均可以引起正常組、假手術組和心衰組小鼠心肌LC3表達水平的升高(P<0.05);雷帕霉素和氯喹聯(lián)合應用可以引起正常組、假手術組小鼠心肌LC3表達的進一步升高(P<0.01)。在心衰組中,雷帕霉素和氯喹組的LC3表達與雷帕霉素組相比無顯著性差異(P>0.05)。
術后28天,在正常組和假手術組中,雷帕霉素可以引起LC3蛋白表達的升高(P<0.05或P<0.01),雷帕霉
23、素和氯喹聯(lián)合應用可以引起LC3蛋白表達的進一步升高(P<0.05或P<0.01)。在心衰組中,雷帕霉素組LC3表達較生理鹽水組略有升高,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05);雷帕霉素和氯喹組LC3表達與雷帕霉素組相比顯著下降(P>0.05)。
2.Real-timePCR結果
與正常組和假手術組相比,心衰組小鼠心肌LC3a的mRNA水平在術后7天明顯升高,達正常組的100-120倍(P<0.01);術后28天降至接
24、近正常水平(P>0.05)。
TAC術后7天,雷帕霉素可以引起正常組和假手術組LC3a的mRNA水平的升高(P<0.05),心衰組LC3amRNA水平略有升高,但無顯著性差異(P>0.05)。雷帕霉素和氯喹聯(lián)合應用均可以進一步升高各組LC3a的mRNA水平。(P<0.05或P<0.01)。
TAC術后28天,雷帕霉素可以引起正常組、假手術組和心衰組的LC3a的mRNA水平的升高(P<0.05或P<0.01),
25、雷帕霉素和氯喹聯(lián)合應用可以進一步升高正常組和假手術組LC3a的mRNA水平(P<0.05或P<0.01)。但在心衰組中,雷帕霉素和氯喹組與雷帕霉素組相比,LC3a的mRNA水平?jīng)]有進一步升高,反而迅速降低(P<0.01)。
與正常組和假手術組相比,心衰組小鼠心肌LC3b的mRNA水平在術后7天明顯升高,達正常組的3-5倍(P<0.05);在術后28天略有升高,無顯著性差異(P>0.05)。
TAC術后7天,雷
26、帕霉素均可誘導正常組、假手術組和心衰組LC3b的mRNA水平的升高(P<0.05或P<0.01);雷帕霉素與氯喹聯(lián)合應用均引起各組LC3b的mRNA水平的進一步升高(P<0.05或P<0.01)。
TAC術后28天,雷帕霉素均可誘導正常組、假手術組和心衰組LC3b的mRNA表達(P<0.05或P<0.01);雷帕霉素與氯喹聯(lián)合應用可進一步誘導正常組、假手術組LC3b的mRNA表達(P<0.01),但在心衰組中,雷帕霉素和氯
27、喹組LC3b表達與雷帕霉素組相比有所升高,但無顯著性差異(P>0.05)。
3.自噬流的改變
免疫組化及PCR結果均顯示:心衰組小鼠在TAC術后7天,心肌自噬功能正常;與正常組和假手術組比較,心衰組雷帕霉素誘導的自噬流無顯著性差異(P>0.05)。術后28天,心衰組小鼠心肌自噬功能異常,與正常組和假手術組比,心衰組雷帕霉素誘導的自噬流明顯減少甚至消失(P<0.01)。
結論:
1.
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- Rubicon在心臟自噬及心功能中的作用研究.pdf
- 凋亡和自噬在心梗后心衰大鼠因瘀致虛的作用.pdf
- 自噬在小鼠腦出血后腦損傷中的作用及機制研究.pdf
- 自噬水平在成年運動小鼠主要器官中的變化.pdf
- 自噬在不同急性肝損傷模型中的變化及調(diào)節(jié)機制的對比研究.pdf
- 自噬在阿霉素誘導小鼠心肌損傷中的作用機制.pdf
- 血管性認知功能障礙小鼠海馬組織自噬相關蛋白表達變化及氯化鋰的干預作用.pdf
- 胰島素、胰高糖素在心衰中的變化.pdf
- α-Synuclein的自噬性降解途徑及可能機制.pdf
- 自噬在MPTP慢性帕金森病小鼠模型中的作用及松果菊苷的干預研究.pdf
- 自噬在糖尿病腎病中的作用及自噬增強劑干預研究.pdf
- 丹酚酸B對局灶性腦缺血小鼠抑制自噬及凋亡機制的研究.pdf
- 自噬在納米氧化鋅誘導小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡中的作用及機制研究.pdf
- miR-30a調(diào)控的心肌自噬在心臟肥厚中的作用.pdf
- 自噬在脂多糖誘導小鼠急性肺損傷中的作用及其機制研究.pdf
- 烏賊墨多糖干預環(huán)磷酰胺介導小鼠睪丸生殖細胞凋亡與自噬的機制研究.pdf
- 自噬在心肌缺血-再灌注損傷中的不同作用.pdf
- 自噬在癲癇大鼠海馬損傷中的作用及機制研究.pdf
- 大負荷運動誘導大鼠骨骼肌線粒體自噬的機制及針刺干預研究.pdf
- 溫和灸對小鼠細菌感染炎癥的影響及其自噬機制研究.pdf
評論
0/150
提交評論