自噬在心衰小鼠中的時序性變化、機制及干預研究.pdf

1、背景：
　　 心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，具有較高的發(fā)病率和死亡率。近年來各種藥物治療使心力衰竭患者的生活質(zhì)量大大提高，但其生存率仍無明顯改善。究其原因，主要是其發(fā)病機制還不十分清楚。自噬是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的降解途徑，細胞通過單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬小體，然后運送到溶酶體形成自噬溶酶體并進行多種酶的消化及降解，以實現(xiàn)細胞自身的代謝和細胞器的更新，自噬對維持細胞的自身穩(wěn)態(tài)具有重要意義。最近

2、的研究表明自噬在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。因此闡明自噬在心衰中的確切作用，有助于進一步了解心衰的發(fā)病機制，為心衰的有效防治提供新的思路和策略。然而，目前自噬在心衰中的具體作用尚不明了，自噬在心衰中的時序性表達變化和對心肌的產(chǎn)生有利或有害作用值得進一步探討。
　　 目的：
　　 建立小鼠主動脈弓縮窄(Transverseaorticarchconstriction，TAC)模型，觀察TAC小鼠心衰進展過程

3、中自噬功能的時序性變化，并探討心衰過程中自噬功能紊亂的可能機制。
　　 實驗Ⅰ：
　　 方法：
　　 1.實驗分組
　　 170只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常組（50只），假手術組（50只）和心衰組（70只）。各組分別于0天、3天、7天、14天、28天處死8-11只小鼠。
　　 2.動物模型的建立
　　 小鼠腹腔注射0.08％戊巴比妥鈉麻醉、固定后，在大體顯微鏡下行TAC術。在頸部中

4、心位置作一縱行10mm切口，鈍性分離左、右頸總動脈，于雙側(cè)頸總動脈分支處盲穿并結扎主動脈弓，27號針頭與主動脈弓一同結扎后，抽出針頭，以控制主動脈弓狹窄率(60±5％)。假手術組的手術步驟同上，但不結扎主動脈弓。
　　 3.存活率分析
　　 保留存活記錄并繪制曲線圖。
　　 4.超聲心動圖檢測
　　 所有小鼠于處死前行經(jīng)胸壁超聲心動圖檢測，計算左室射血分數(shù)（Ejectionfraction，EF％）、左室

5、重量(Leftventricularmassweight，LVMW)。
　　 5.組織病理學及免疫組織化學染色檢查
　　 留取小鼠心臟標本，行蘇木素-伊紅染色(Haematoxylineosin，HE)、Masson染色，觀察心臟大體形態(tài)學改變;行免疫組織化學染色檢測心肌內(nèi)各指標的表達:
　　 (1)自噬指標:微管相關蛋白1輕鏈3（Microtubule-associateprotein1lightchain3，

6、LC3）、Bcl-2相互作用蛋白(Bcl-2interactingcoiled-coilprotein-1,Beclin-1)、Beclin-1相互作用蛋白(RUNdomainproteinasBeclin1-interactingandcysteine-richcontaining,Rubicon)、P62(Sequestosome1/SQSTM1);
　　 (2)炎癥指標:單核細胞趨化蛋白-1(Monocytechemoat

7、tractantprotein-1,MCP-1)、細胞間粘附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)、Toll樣受體4(Toll-likereceptor4，TLR4)、髓樣分化因子88(Myeloiddifferentiationfactor88，Myd88)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(Tissuein

8、hibitorofmatrixmetalloprotease-1，TIMP-1);
　　 (3)氧化應激指標:4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)、8-羥基-2'-脫氧鳥苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8OHdG）。
　　 6.實時定量聚合酶鏈反應(Real-timequantitativepolymerasechainreaction,Real-timePCR):檢

9、測心肌內(nèi)LC3a、LC3b、自噬相關基因(Autophagy-relatedgene,Atg)Atg5、Atg7、Rubicon、Beclin-1的表達。
　　 7.統(tǒng)計學分析
　　 統(tǒng)計學處理計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組數(shù)據(jù)間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用包含Bonferronipost-hoc檢驗的單因素或雙因素方差分析。多組間的兩兩比較采

10、用費希爾的LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.實驗動物的一般情況
　　 本研究共120只小鼠進行了手術，50只為假手術組，只掛線不結扎主動脈弓，1只死于麻醉意外，其余全部存活;70只為心衰組，TAC手術當天存活小鼠56只，手術成功率為80％。
　　 2.心臟超聲學檢測結果
　　 心臟超聲圖像顯示術后28天心衰組小鼠左心室室壁變薄，心腔明顯擴大，心肌收縮力減退。與正常

11、組和假手術組相比，心衰組小鼠術后EF％明顯下降，術后第3天由術前的73.4±3.5％降至41±10.4％（P＜0.01）;術后7天至28天EF％下降較緩慢，術后28天小鼠EF％為36.2±5.7％(P＜0.01)。心衰組小鼠術后LVMW較正常組和假手術組顯著增高(P＜0.05)，術后3天LVMW由42.2±10.2增至52.5±12.7，術后28天增至58.2±11.0。
　　 3.病理學檢測
　　 (1)病理學染色

12、r>　　 HE染色和Masson染色均顯示隨著心衰時間的延長，心衰組小鼠心肌細胞直徑增大，心臟橫徑和左心室腔不斷增大。術后28天心肌纖維化明顯，與正常組和假手術組比較具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 (2)自噬因子表達變化
　　 與正常組和假手術組相比，心衰組小鼠心肌LC3表達明顯增高，呈雙峰分布，在3天和7天表達持續(xù)升高，在7天達到第一個峰值（P＜0.01）;在14天略有降低(P＜0.05或P＜0

13、.01);在28天表達明顯增強，達到第二個峰值（P＜0.01）。與正常組和假手術組相比，心衰組小鼠心肌Beclin-1表達在術后3天和7天，明顯升高（P＜0.01）。
　　 與正常組和假手術組相比，心衰組小鼠心肌P62表達在7天和28天顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 與正常組和假手術組相，心衰組小鼠心肌Rubicon的表達在術后3天、7天、14天、28天均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　

14、　 (3)炎癥因子表達變化
　　 與正常組和假手術組相比，心衰組小鼠心肌MCP-1表達明顯升高，呈雙峰分布，在3天表達較高（P＜0.01），在7天表達略有減低(P＜0.05或P＜0.01)，在14天和28天又持續(xù)升高（P＜0.01）。
　　 與正常組和假手術組相比，心衰組小鼠心肌ICAM-1表達在各時間點均顯著升高，在7天、28天表達較高（P＜0.01），3天、14天表達略低（P＜0.05）。與正常組和假手術組相比，心

15、衰組小鼠心肌MMP-9表達在14天、28天表達略有升高(P＜0.05)。
　　 與正常組和假手術組相比，心衰組TIMP-1表達在28天顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，余無顯著性差異。
　　 與正常組和假手術組相比，心衰組TLR4表達在各時間點均顯著升高，并隨時間不斷增強，與正常組和假手術組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 與正常組和假手術組相比，心衰組小鼠Myd88表達在14天

16、顯著升高（P＜0.05），余無顯著性差異。
　　 (4)氧化應激因子表達變化
　　 心衰組小鼠心肌80HdG的表達明顯增強，術后3天陽性率為24.18±6.63％，較假手術組(10.40±4.54％)和正常組(3.13±1.33％)顯著增強（P＜0.05或P＜0.01）;術后7天略下降至11.58±3.05％;術后14天、28天又持續(xù)上升(分別為28.56±7.31％,P＜0.05;30.79±7.47％，P＜0.01)

17、。心衰組小鼠心肌4-HNE表達也顯著增強，在術后3天升高至正常組的6-7倍，7天略下降至3-4倍，14天、28天又升高至4-6倍，與正常組和假手術組比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　 4.Real-timePCR結果
　　 與正常組和假手術組比較，心衰組小鼠心肌LC3amRNA的水平隨時間呈單峰分布，在7天達到最高（P＜0.01），余時間點無顯著性差異;
　　 與正常組和假手術組比較，心衰組LC3b的mR

18、NA表達水平也呈單峰分布，在3天、7天表達最高（P＜0.05），28天恢復到正常水平;
　　 與正常組和假手術組比較，心衰組小鼠心肌Atg5mRNA表達水平在3天、7天、14天明顯增高(P＜0.01)，在28天基本降至基礎水平;
　　 與正常組和假手術組比較，心衰組小鼠心肌Atg7mRNA表達水平在3天明顯升高（P＜0.01），達到高峰，在28天基本降至基礎水平，余時間點差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　

19、與正常組和假手術組比較，心衰組小鼠心肌Beclin-1mRNA表達水平表現(xiàn)為在第3天顯著升高（P＜0.01），在7天、14天迅速降至基礎水平，在28天略有升高，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 與正常組和假手術組比較，心衰組小鼠心肌Rubicon的mRNA表達水平隨時間呈雙峰分布，在7天、28天達到最高值（P＜0.01），14天略有降低（P＜0.05）。
　　 實驗Ⅱ：
　　 方法：
　　 1.實驗

20、動物
　　 180只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常組（50只），假手術組（50只）和心衰組（80只）。以上各組組內(nèi)又隨機分為3個亞組:雷帕霉素組、雷帕霉素加氯喹組和生理鹽水組，共9個亞組。各亞組分別于TAC術后7天、28天處死8-10只小鼠，小鼠處死前4h分別給予腹腔注射雷帕霉素(30mg/kg)或（和）氯喹(2mg/kg)或生理鹽水(0.2ml)。
　　 2.動物模型的建立
　　 動物模型的建立方法同實驗Ⅰ

21、。
　　 3.病理學檢測
　　 LC3免疫組化檢測各組心肌LC3的蛋白表達水平。
　　 4.Real-timePCR檢測
　　 檢測各組LC3a、LC3b的mRNA表達水平。
　　 結果：
　　 1.病理學染色
　　 在不應用雷帕霉素和氯喹干預情況下，術后7天心衰組小鼠心肌LC3表達陽性率為21.43±2.9％，術后28天達28.20±3.24％，與正常組和假手術組比較均具有顯著性

22、差異（P＜0.01）。
　　 術后7天，雷帕霉素均可以引起正常組、假手術組和心衰組小鼠心肌LC3表達水平的升高(P＜0.05);雷帕霉素和氯喹聯(lián)合應用可以引起正常組、假手術組小鼠心肌LC3表達的進一步升高（P＜0.01）。在心衰組中，雷帕霉素和氯喹組的LC3表達與雷帕霉素組相比無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 術后28天，在正常組和假手術組中，雷帕霉素可以引起LC3蛋白表達的升高（P＜0.05或P＜0.01），雷帕霉

23、素和氯喹聯(lián)合應用可以引起LC3蛋白表達的進一步升高(P＜0.05或P＜0.01)。在心衰組中，雷帕霉素組LC3表達較生理鹽水組略有升高，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;雷帕霉素和氯喹組LC3表達與雷帕霉素組相比顯著下降（P＞0.05）。
　　 2.Real-timePCR結果
　　 與正常組和假手術組相比，心衰組小鼠心肌LC3a的mRNA水平在術后7天明顯升高，達正常組的100-120倍(P＜0.01);術后28天降至接

24、近正常水平(P＞0.05)。
　　 TAC術后7天，雷帕霉素可以引起正常組和假手術組LC3a的mRNA水平的升高(P＜0.05)，心衰組LC3amRNA水平略有升高，但無顯著性差異（P＞0.05）。雷帕霉素和氯喹聯(lián)合應用均可以進一步升高各組LC3a的mRNA水平。(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 TAC術后28天，雷帕霉素可以引起正常組、假手術組和心衰組的LC3a的mRNA水平的升高（P＜0.05或P＜0.01），

25、雷帕霉素和氯喹聯(lián)合應用可以進一步升高正常組和假手術組LC3a的mRNA水平（P＜0.05或P＜0.01）。但在心衰組中，雷帕霉素和氯喹組與雷帕霉素組相比，LC3a的mRNA水平?jīng)]有進一步升高，反而迅速降低(P＜0.01)。
　　 與正常組和假手術組相比，心衰組小鼠心肌LC3b的mRNA水平在術后7天明顯升高，達正常組的3-5倍(P＜0.05);在術后28天略有升高，無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 TAC術后7天，雷

26、帕霉素均可誘導正常組、假手術組和心衰組LC3b的mRNA水平的升高(P＜0.05或P＜0.01);雷帕霉素與氯喹聯(lián)合應用均引起各組LC3b的mRNA水平的進一步升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 TAC術后28天，雷帕霉素均可誘導正常組、假手術組和心衰組LC3b的mRNA表達(P＜0.05或P＜0.01);雷帕霉素與氯喹聯(lián)合應用可進一步誘導正常組、假手術組LC3b的mRNA表達（P＜0.01），但在心衰組中，雷帕霉素和氯

27、喹組LC3b表達與雷帕霉素組相比有所升高，但無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 3.自噬流的改變
　　 免疫組化及PCR結果均顯示:心衰組小鼠在TAC術后7天，心肌自噬功能正常;與正常組和假手術組比較，心衰組雷帕霉素誘導的自噬流無顯著性差異（P＞0.05）。術后28天，心衰組小鼠心肌自噬功能異常，與正常組和假手術組比，心衰組雷帕霉素誘導的自噬流明顯減少甚至消失(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 1.