自噬在納米氧化鋅誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　納米氧化鋅（Zinc oxide nanoparticles，ZnO NPs）在工業(yè)中廣泛應(yīng)用，其除對肝臟和神經(jīng)有毒性之外，還對雄性生殖系統(tǒng)有毒性，但其確切機(jī)制仍不甚清楚。本課題主要通過觀察ZnO NPs對活體雄性小鼠睪丸組織和小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的影響，探究自噬在ZnO NPs誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：
　　用HE染色檢測ZnO NPs對小鼠睪丸及附睪的病理損傷，用Western

2、 blot檢測ZnO NPs對小鼠睪丸組織的凋亡和自噬的影響，活性氧檢測試劑盒檢測ZnO NPs對小鼠睪丸組織和小鼠睪丸間質(zhì)TM3細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。用ELISA法檢測ZnO NPs對小鼠血清睪酮含量的影響。用MTT法檢測ZnO NPs和H2O2對小鼠睪丸間質(zhì)TM3細(xì)胞活性的影響；分別用Western blot和Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測ZnO NPs對TM3細(xì)胞凋亡的影響；分別用Western blot和電鏡檢測Z

3、nO NPs和H2O2對TM3細(xì)胞自噬的影響。
　　結(jié)果：
　　用不同濃度的ZnO NPs（0,100,200,400 mg/kg/d）連續(xù)給小鼠灌胃28天后，與對照組相比，ZnO NPs對小鼠睪丸及附睪系數(shù)無明顯影響（P＞0.05）。HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠睪丸生精細(xì)胞排列整齊、緊致；與對照組相比，100 mg/kg ZnO NPs處理組的小鼠睪丸生精細(xì)胞排列也比較整齊，并無明顯的生精細(xì)胞脫落；200及400 mg/k

4、g ZnO NPs處理組的小鼠睪丸生精細(xì)胞排列明顯紊亂、松散，并出現(xiàn)不同程度的脫落。ZnO NPs還顯著降低小鼠附睪中的精子數(shù)量。Western blot結(jié)果顯示， ZnO NPs可增加小鼠睪丸組織內(nèi) cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3、Bax蛋白含量并抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，提示ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織凋亡。ZnO NPs還可使小鼠睪丸組織內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3-II含量、LC3-II/LC

5、3-I的比例以及自噬相關(guān)蛋白Atg-5和 Beclin-1的表達(dá)顯著增加，提示ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織自噬。與對照組相比，ZnO NPs處理組小鼠睪丸組織中的MDA和GSH含量分別增加和降低；ZnO NPs還呈濃度依賴式地抑制小鼠睪丸組織內(nèi)SOD和GSH-PX的活性，提示ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激。ELISA結(jié)果顯示， ZnO NPs可顯著降低小鼠血清中睪酮含量（P＜0.05），提示ZnO NPs可能影響睪丸間

6、質(zhì)細(xì)胞的功能。
　　體外實驗表明，ZnO NPs呈濃度依賴式地抑制小鼠睪丸間質(zhì)TM3細(xì)胞活性（P＜0.05），并顯著增加TM3細(xì)胞內(nèi)cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和Bax蛋白含量和抑制細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)，提示ZnO NPs可誘導(dǎo)TM3細(xì)胞凋亡。Annexin V-FITC和PI雙染色法進(jìn)一步證實ZnO NPs可誘導(dǎo)TM3細(xì)胞凋亡。ZnO NPs可誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激（P＜

7、0.05）；H2O2在顯著抑制TM3細(xì)胞活性的同時（P＜0.05），還可誘導(dǎo)TM3細(xì)胞凋亡，而在用N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine， NAC）抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激后，ZnO NPs對細(xì)胞活性的抑制和凋亡的誘導(dǎo)作用均明顯減弱。以上結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激參與了ZnO NPs對TM3細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。Western blot結(jié)果顯示，ZnO NPs和H2O2可誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)TM3細(xì)胞自噬，用NAC抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激后，Z