丹酚酸B對局灶性腦缺血小鼠抑制自噬及凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、目的:腦血管病是導(dǎo)致我國成人殘疾和死亡的第一原因，其中以缺血性腦血管病最為常見。腦缺血后繼發(fā)性腦損傷是病情加重及影響預(yù)后的重要原因，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及線粒體功能異常、鈣超載、興奮氨基酸毒性、自噬等因素均有參與。缺血性腦血管病機(jī)制復(fù)雜不明，目前缺乏有效治療手段，是亟待解決的醫(yī)學(xué)問題。
　　急性局灶腦缺血中，氧化應(yīng)激可介導(dǎo)梗死區(qū)域繼發(fā)性神經(jīng)元死亡。自噬在缺血再灌注情況下是一把雙刃劍，細(xì)胞可啟動適度的自噬來清除受損細(xì)胞器及異

2、常折疊蛋白質(zhì)，對細(xì)胞起到重要的保護(hù)作用，但不完全或過度自噬現(xiàn)象可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。近來越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，氧化應(yīng)激能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，并且，應(yīng)用抗氧化劑能抑制自噬并減少細(xì)胞死亡。
　　丹酚酸B(Salvianolic acid B，SalB)是一種提取自丹參的水溶性單體成分，具有強(qiáng)大的抗氧化作用及其他多種生物學(xué)活性。SalB可以通過抑制凋亡的機(jī)制保護(hù)缺血心肌細(xì)胞，也有文獻(xiàn)報(bào)道SalB可通過抑制自噬來保護(hù)饑餓狀態(tài)的心肌細(xì)胞。

3、　　本實(shí)驗(yàn)旨在研究SalB這一氧自由基清除劑對急性期局灶性腦缺血小鼠是否存在腦保護(hù)作用，且其作用機(jī)制是否為抑制凋亡及自噬水平。
　　方法:采用雄性CD1小鼠（體重25-30g），應(yīng)用改良Longa法建立小鼠右側(cè)pMCAO模型。實(shí)驗(yàn)分為三部分:
　　實(shí)驗(yàn)一:探究SalB對急性期局灶性腦缺血小鼠的腦保護(hù)作用
　　小鼠隨機(jī)分為4組:Sham組（Sham+生理鹽水）、pMCAO組(pMCAO+生理鹽水)、丹酚酸B低劑量組（pM

4、CAO+SalB10mg/kg，Sal-L）、丹酚酸B高劑量組（pMCAO+SalB25mg/kg，Sal-H）。各組小鼠按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行麻醉與造模，造模成功后，藥物干預(yù)組即刻腹腔注射SalB，Sham組和pMCAO組用則給予等量生理鹽水。術(shù)后24 h采用Longa法及Clark法對小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。評分完畢后將動物斷頭處死，用干濕重法測定腦組織含水量，用TTC染色法測定腦梗死體積，用伊文斯蘭染色法測定血腦屏障通透性，用west

5、ern blot測定緊密連接蛋白Claudin-5的含量，用尼氏染色法測定梗死交界區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷情況，用電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變（梗死皮層超微結(jié)構(gòu)如自噬體的形成、細(xì)胞凋亡情況和微血管損傷情況等）。
　　實(shí)驗(yàn)二:局灶性腦缺血小鼠各因子分區(qū)表達(dá)
　　對Sham及pMCAO組小鼠于術(shù)后24h行免疫組織化學(xué)染色測定LC3、beclin1、p62、bcl2、bax、Caspase-3的陽性細(xì)胞分布情況及計(jì)數(shù)情況。行免疫熒光染色觀察becl

6、in1及Caspase-3是否存在共標(biāo)。觀察western blot測定PGC-1α及Sirt1的分區(qū)表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)三:SalB腦保護(hù)作用機(jī)制的探究
　　首先，根據(jù)因子分區(qū)表達(dá)情況選定測定的分區(qū):LC3、beclin1、p62于梗死周邊區(qū)觀察;bcl2、bax、cleaved Caspase-3于梗死中心區(qū)觀察。應(yīng)用western blot及RT-qPCR進(jìn)行測定Sham組、pMCAO組、Sal-L組、Sal-H組相應(yīng)分區(qū)

7、各因子的蛋白、mRNA含量的變化。
　　對不同分區(qū)凋亡相關(guān)信號通路重要因子MAPKs及能量代謝通路重要因子PGC-1α及Sirt1行western blot及RT-qPCR測定其蛋白、mRNA含量的變化。用DHE染色測定梗死側(cè)皮層ROS的生成量，分別應(yīng)用MDA含量及SOD活力試劑盒測定梗死皮層脂質(zhì)過氧化程度及機(jī)體清除氧自由基的能力。
　　總之，分別從凋亡、自噬、氧化應(yīng)激三方面探討丹酚酸B腦保護(hù)作用機(jī)制。
　　結(jié)果:

8、r>　　1、丹酚酸B對急性期局灶性腦缺血小鼠具有保護(hù)作用
　　1.1丹酚酸B改善行為學(xué)評分
　　pMCAO術(shù)后24 h，分別采用Longa法及Clark法對各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)評分，對此采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)并分析結(jié)果。采用Longa評分法及Clark評分法時(shí)，與pMCAO組相比，Sal-L組和Sal-H組的神經(jīng)功能評分明顯改善，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　1.2丹酚酸B降低腦梗死體積<

9、br>　　pMCAO術(shù)后24 h，Sal-L組和Sal-H組因藥物干預(yù)梗死體積明顯減小，且差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Sal-L組和Sal-H組vs.pMCAO組:51.09％±12.65％和34.31％±7.93％ vs.65.94％±2.96％,P＜0.05）。
　　1.3丹酚酸B保護(hù)血腦屏障
　　1.3.1丹酚酸B減輕腦水腫: pMCAO術(shù)后24 h，Sal-L組和Sal-H組梗死側(cè)腦組織含水量較pMCAO組明顯減少(P＜0.0

10、5)。
　　1.3.2丹酚酸B降低血腦屏障通透性:局灶性腦缺血后24h，Sal-L組和Sal-H組右側(cè)大腦半球腦組織伊文斯蘭含量均明顯低于pMCAO組（P＜0.05）。
　　1.3.3丹酚酸B上調(diào)Claudin5表達(dá):局灶性腦缺血后24h pMCAO組右側(cè)大腦半球Claudin5蛋白表達(dá)量降低，與Sham組比較有差異（P＜0.05）。pMCAO組左側(cè)半球與Sham組的Claudin5蛋白含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用SalB干預(yù)后，

11、Claudin5含量增加，緊密連接崩解減少，血腦屏障受到保護(hù)。
　　1.3.4丹酚酸B保護(hù)血腦屏障超微結(jié)構(gòu)
　　取右側(cè)大腦半球皮層行電鏡檢測，結(jié)果顯示:除Sham組外均有不同程度內(nèi)皮細(xì)胞受損，細(xì)胞核增大，緊密連接開放，基底膜模糊，可見紅細(xì)胞阻塞微血管，管周有液體滲出，周圍腦組織細(xì)胞水腫。pMCAO組最為嚴(yán)重，周圍組織高度水腫;Sal-H組較pMCAO組管周液體滲出減少，緊密連接較完好且基底膜更為完整。
　　1.4丹酚酸

12、B減少神經(jīng)細(xì)胞損傷
　　1.4.1丹酚酸B增加尼氏染色中存活細(xì)胞數(shù)目，Sal-L組和Sal-H組較pMCAO組存活細(xì)胞數(shù)目增多(P＜0.05)。
　　1.4.2丹酚酸B改善組織超微結(jié)構(gòu)，同時(shí)還可觀察到局灶性腦缺血后的自噬現(xiàn)象，pMCAO組小鼠梗死灶周圍皮層可見直徑平均500nm的雙層膜的自噬小體。
　　2、局灶性腦缺血后不同區(qū)域因子表達(dá)變化不同
　　2.1 pMCAO及Sham術(shù)后24小時(shí)，Caspase-3、b

13、ax、bcl2的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Sham組bax及Caspase-3表達(dá)量很少，bcl2作為抗凋亡因子在正常組織中有一定程度的表達(dá)。梗死對側(cè)皮層組各因子陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)與Sham組無明顯差異;梗死中心皮層組Caspase-3及bax表達(dá)明顯上升，陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增多（Core vs.Sham，P＜0.05），bcl2表達(dá)明顯下調(diào)，陽性細(xì)胞數(shù)目減少（Core vs.Sham，P＜0.05）;梗死周邊皮層組Caspase-3及bax表達(dá)有

14、所上調(diào)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)但幅度遠(yuǎn)小于梗死中心皮層，bcl2表達(dá)上調(diào)且陽性細(xì)胞數(shù)增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　pMCAO組中，梗死中心皮層組各自噬相關(guān)指標(biāo)幾乎未見陽性細(xì)胞，與Sham組有顯著差別，梗死對側(cè)皮層組自噬相關(guān)指標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)目與Sham組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。梗死周邊皮層自噬水平顯著提高，LC3、beclin1及p62表達(dá)均顯著上升(P＜0.05)。
　　2.2免疫熒光顯示beclin1+與C

15、aspase-3+細(xì)胞有明顯分界，未觀察到存在了beclin1+/Caspase-3+細(xì)胞包。
　　2.3腦缺血組織分區(qū):將腦皮層分為梗死對側(cè)皮層(Contralateral)，梗死周邊皮層(Pericore)及梗死中心皮層(Core)。Core組PGC-1α及Sirt1蛋白表達(dá)水平較sham組明顯下調(diào)，pericore組及contralateral組則較sham組上升。
　　3、丹酚酸B腦保護(hù)作用機(jī)制的探究
　　3.

16、1丹酚酸B的抗氧化作用:SalB通過清除ROS、降低梗死半球腦組織MDA含量并恢復(fù)SOD活性來抗氧化。
　　3.2丹酚酸B的抗凋亡作用:術(shù)后24小時(shí)，western blot結(jié)果顯示CleavedCaspase-3/GADPH及bax/bcl2比值較Sham組明顯升高。Sal-L組和Sal-H組較pMCAO組的Cleaved Caspase-3/GADPH及bax/bcl2比值明顯降低。RT-qPCR結(jié)果符合組織化學(xué)染色結(jié)果。用藥

17、后，Sal-L和Sal-H的Caspase-3及bax基因表達(dá)降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.3丹酚酸B抑制自噬的作用
　　自噬相關(guān)指標(biāo)在蛋白表達(dá)層面包括LC3Ⅱ/GADPH、beclin1/GADPH及p62/GADPH;其相對應(yīng)基因表達(dá)層面包括MAP1LC3b/ACTB、BECN1/ACTB及SQSTM1/ACTB。低劑量的SalB干預(yù)可明顯降低各個(gè)指標(biāo)的表達(dá)量，高劑量效果較之稍遜色。與western blotting結(jié)果

18、一致，pMCAO組各指標(biāo)mRNA的表達(dá)較Sham組明顯增加。與pMCAO組相比，Sal-L組各指標(biāo)的表達(dá)量明顯減少，高劑量較之效果遜色，與Western blot結(jié)果一致。
　　3.4丹酚酸B下調(diào)梗死中心皮層p-p38及p-erk1/2表達(dá)
　　3.5丹酚酸B上調(diào)梗死周圍皮層Sirt1-PGC-1α通路的蛋白及基因表達(dá)
　　結(jié)論:
　　SalB對急性期局灶性腦缺血小鼠的具有腦保護(hù)作用，可以改善神經(jīng)功能缺損評分（L

19、onga法及Clark法），降低梗死體積，保護(hù)血腦屏障，增加增加尼氏染色中存活細(xì)胞數(shù)目以及改善組織超微結(jié)構(gòu)。
　　局灶性腦缺血中可觀察到細(xì)胞自噬現(xiàn)象，可見典型自噬體形成及自噬溶酶體的形成，也可觀察到典型的細(xì)胞凋亡。免疫組織化學(xué)檢測自噬相關(guān)因子及凋亡相關(guān)因子的表達(dá)及分布，發(fā)現(xiàn)兩者分布不同。自噬相關(guān)指標(biāo)于梗死周邊皮層表達(dá)上調(diào)（如LC3及beclin1），凋亡相關(guān)指標(biāo)主要于梗死中心皮層明顯變化（如cleaved Caspase-3及ba

20、x上調(diào)，bcl2下調(diào)），且Beclin1及Caspase-3進(jìn)行雙標(biāo)免疫熒光染色時(shí)未見共標(biāo)。說明應(yīng)分區(qū)討論于是取不同部位皮層進(jìn)行蛋白及基因水平檢測。
　　SalB可于pericore區(qū)抑LC3Ⅱ及beclin1表達(dá)，但p62表達(dá)也減少并未堆積，說明自噬水平雖然降低，但自噬溶酶體仍能降解底物，說明SalB抑制了過度激活的自噬水平。Sirt1-PGC-1α也在此區(qū)域明顯激活，有利于能量代謝順利進(jìn)行，減少損傷的線粒體，從而減低自噬的刺激