丹皮酚對局灶性腦缺血的保護(hù)作用及對pAkt、Nrf2和HO-1調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 腦血管病是我國居民死亡和致殘的首位原因，以缺血性腦血管病最為常見。腦缺血后繼發(fā)損傷是一個復(fù)雜的病理級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)病機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)、細(xì)胞毒性作用等。氧化應(yīng)激廣泛存在于腦梗死后壞死和缺血區(qū)域，是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的主要因素。已有研究表明，大量氧自由基的產(chǎn)生會引起氧化應(yīng)激加劇脂質(zhì)，DNA等大分子物質(zhì)的損傷。腦作為人體耗氧量最大的器官，含有大量脂質(zhì)，對氧化應(yīng)激損傷最為敏感。如何減輕氧化應(yīng)激損傷已逐

2、漸成為臨床治療缺血性腦血管病的的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。
　　 磷酸化的Akt可以有效影響腦梗死的病理進(jìn)展。絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt又名蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，在一系列細(xì)胞凋亡、能量代謝、基因表達(dá)等過程中通過調(diào)節(jié)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄基因發(fā)揮重要作用。Akt可以使轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2激活，在腦缺血后機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
　　 轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(NF-E2 re

3、lated factor 2，Nrf2)是細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵因子及中樞調(diào)節(jié)者，通過與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）相互作用，在自身防御機(jī)制中起著非常重要的作用。Nrf2通過誘導(dǎo)一系列抗氧化劑保護(hù)蛋白編碼，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)環(huán)境的條件調(diào)節(jié)，是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激的重要通路。Nrf2/ARE信號通路可誘導(dǎo)多種化學(xué)保護(hù)Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶，提高谷胱甘肽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶及超氧化物

4、歧化酶等抗氧化物質(zhì)的表達(dá)。其中HO-1是重要的Ⅱ相解毒酶，是普遍存在的應(yīng)激蛋白，可以通過催化血紅素代謝為CO、鐵、膽綠素等發(fā)揮其強(qiáng)大的抗氧化能力。現(xiàn)HO-1已成為反映細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的重要指標(biāo)。綜上所述，Nrf2信號的激活可以有效清除自由基等氧化物質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原水平，發(fā)揮其重要的細(xì)胞保護(hù)作用。
　　 丹皮酚(Paeonol，PN)是從毛莨科植物牡丹根皮與蘿摩科植物徐長卿干燥根或全草中提取的主要有效成分，是天然的抗氧化劑

5、，其藥理活性十分廣泛。大量實(shí)驗(yàn)研究表明丹皮酚通過發(fā)揮其抗炎、抗氧化作用在治療阿爾茲海默病、糖尿病、腫瘤等方面具有重要作用。除此之外，丹皮酚可以減少氧自由基，減輕氧化應(yīng)激改善D-半乳糖誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙?，F(xiàn)通過經(jīng)典pMCAO模型探究丹皮酚是否具有腦保護(hù)作用，以及其作用機(jī)制與phospho-Akt、Nrf2、HO-1、Claudin-5以及超氧化物岐化酶的活性是否相關(guān)。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)分為兩部分:
　　 實(shí)驗(yàn)一

6、，丹皮酚的腦保護(hù)作用研究。
　　 實(shí)驗(yàn)二，丹皮酚治療組的phospho-Akt、Nrf2、HO-1的含量變化。
　　 實(shí)驗(yàn)一:采用成年健康雄性CD-1(ICR)小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、單梗組(pMCAO)、溶劑對照組(Vehicle)、丹皮酚小劑量(30 mg/kg)組(PN-L)及丹皮酚大劑量(60 mg/kg)組(PN-H)。制作小鼠右側(cè)大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery w

7、as occluded，MCAO)。術(shù)前三天連續(xù)灌胃給藥，大腦中動脈阻塞術(shù)前30分鐘再次灌胃給予丹皮酚溶液(30 mg/kg或60 mg/kg)，并于術(shù)后24小時進(jìn)行神經(jīng)功能評分，完畢后動物斷頭處死，留取病變側(cè)腦組織采用干濕重法對腦含水量進(jìn)行測定，采用2％2，3，5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色測定腦梗死體積。
　　 實(shí)驗(yàn)二:采用成年健康雄性CD-1(ICR)小鼠，隨機(jī)

8、分為假手術(shù)組(Sham)、單梗組(pMCAO)、溶劑對照組(Vehicle)、丹皮酚小劑量(30 mg/kg)組(PN-L)及丹皮酚大劑量（60 mg/kg）組(PN-H)。干預(yù)組采取灌胃給藥。采用蛋白印跡法(Western Blot)測定pAkt、Nrf2、HO-1以及Claudin-5的蛋白水平，實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qR-T PCR)測定Nrf2、HO-1以及Claudin-5的mRNA表達(dá)情況。應(yīng)用試劑盒檢測小鼠大腦皮層梗塞灶中

9、超氧化物岐化酶(SOD)的活性變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.采用6分法評價小鼠神經(jīng)功能行為學(xué)。評分于MCAO術(shù)后24 h進(jìn)行。PN-H組與Vehicle組相比，神經(jīng)功能缺損顯著改善(P＜0.05)。PN-L組雖較Vehicle組可降低評分，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.比較手術(shù)同側(cè)腦含水量。假手術(shù)組為79.08±0.78％，pMCAO組與Vehicle組相比，含水量相近差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。Vehicle

10、組為84.61％±0.61％，與其相比，丹皮酚治療組腦組織含水量降低并具有統(tǒng)計學(xué)差異(Vehicle vs.PN-L:84.61％±0.61％vs.82.16±1.02％;Vehicle vs.PN-H.84.61％±0.61％vs.81.68±1.23％)(P＜0.05)。比較手術(shù)對側(cè)腦含水量，5組基本相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.假手術(shù)組大腦皮層未見梗死灶。與溶劑對照組相比，PN大劑量組梗死體積明顯減小

11、(P＜0.05)，PN小劑量組雖可減小梗死體積，但與溶劑對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4.丹皮酚對phospho-Akt、Nrf2、HO-1表達(dá)的影響:與Vehicle組相比，PN-L和PN-H兩組中的phospho-Akt、HO-1在蛋白水平的表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，PN-H組Nrf2在細(xì)胞核內(nèi)積累增多(P＜0.05)，同樣，在PCR的檢測中發(fā)現(xiàn)，丹皮酚大劑量組較溶劑對照組相比Nrf2，HO-1mR

12、NA表達(dá)水平也明顯升高(P＜0.05)。
　　 5.丹皮酚對Claudin-5表達(dá)的影響:與溶劑對照組相比，PN高劑量與低劑量組上調(diào)Claudin-5在蛋白水平表達(dá)，高劑量組亦可使Claudin-5mRNA表達(dá)增多。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6.丹皮酚對SOD的影響:相比于Sham組，小鼠腦缺血后梗塞灶皮層中超氧化物岐化酶(SOD)的活性反射性升高(P＜0.05)。丹皮酚干預(yù)后，SOD活性進(jìn)一步升高，

13、與Sham組、Vehicle組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 給予丹皮酚進(jìn)行早期腦梗死干預(yù)后，明顯降低腦水腫程度，減少梗死體積，改善神經(jīng)功能行為學(xué)評分;進(jìn)一步的研究表明丹皮酚可上調(diào)了phospho-Akt、Nrf2、HO-1和Claudin-5的表達(dá)水平，增加SOD的活性，改善血腦屏障的通透性。對腦缺血后腦組織具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活A(yù)kt/Nrf2/HO-1通路有關(guān)，為丹皮酚臨床應(yīng)