綠茶多酚對(duì)TDP-43相關(guān)的肌萎縮側(cè)索硬化的細(xì)胞模型的保護(hù)作用.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）是一種進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，選擇性侵犯腦與脊髓的上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，主要表現(xiàn)為全身進(jìn)行性肌無力和肌肉萎縮。雖然近年來有關(guān)ALS的研究較多且已較為深入，但其確切病因及發(fā)病機(jī)制仍然不明。肌萎縮側(cè)索硬化可引起死亡及長(zhǎng)期殘障，是世界范圍內(nèi)治愈的難題之一。肌萎縮側(cè)索硬化給家庭社會(huì)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，遏制其發(fā)生，研究發(fā)生機(jī)制是醫(yī)務(wù)工作者不可推卸的責(zé)任。

2、r>　　最近，在ALS患者的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的胞核和胞漿中均發(fā)現(xiàn)了異常泛素化的蛋白聚集體，主要成分是43kDa的TARDNA結(jié)合蛋白(TDP-43)。
　　TARDNA結(jié)合蛋白(TDP-43)由TARDBP基因編碼，本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，具有414個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為43000。它包含2個(gè)RNA識(shí)別區(qū)和一個(gè)富含甘氨酸的末端，使其可以結(jié)合單鏈DNA。主要功能為轉(zhuǎn)錄和剪切調(diào)控。另外有研究發(fā)現(xiàn)，TDP-43缺失的小鼠體內(nèi)存在mRNA減

3、少、剪接錯(cuò)誤，及一些非編碼RNA。生理性TDP-43蛋白的分布主要在細(xì)胞核，少量出現(xiàn)在核周胞質(zhì)。TDP-43蛋白表達(dá)受到許多信號(hào)如核定位信號(hào)和轉(zhuǎn)移信號(hào)的調(diào)控，并易于受到機(jī)體各種生理狀態(tài)的影響。在疾病和應(yīng)激狀態(tài)下，TDP-43蛋白可表現(xiàn)為一系列病理形態(tài)學(xué)改變，如核內(nèi)包涵體、胞質(zhì)聚集體等。TARDBP基因突變以及磷酸化、泛素化和N末端截短等修飾過程都可導(dǎo)致出現(xiàn)病理性TDP-43蛋白。與生理性結(jié)構(gòu)比較，病理性TDP-43蛋白狀態(tài)不穩(wěn)定而更易聚

4、集。TDP-43在ALS的病理過程中發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制尚不清楚。
　　眾所周知，茶多酚是茶葉中含有的一類多羥基酚類化合物的總稱，其中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的含量最高，占綠茶多酚的25％-40％左右，被認(rèn)為是綠茶多酚生物學(xué)活性的主要來源。綠茶多酚GTP可以作為金屬螯合劑和自由基清除劑，另外，還影響細(xì)胞存活和凋亡基因的過度表達(dá)以調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、線粒體功能和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)。通過這些機(jī)制，綠茶多酚對(duì)帕金森病

5、(PD)和阿爾茨海默病(AD)等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病具有防治作用。自噬是長(zhǎng)壽命蛋白和細(xì)胞器再循環(huán)和更新的一種降解機(jī)制。許多神經(jīng)變性疾?。ㄈ绨柶澓ＤY，帕金森病，多聚谷氨酰氨病和ALS）都是以錯(cuò)誤折疊的蛋白聚集為特征的。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，自噬已成為了清除錯(cuò)誤折疊蛋白的重要途徑，并對(duì)神經(jīng)元正常功能的維持起著重要作用;相反，下調(diào)或部分抑制自噬水平有時(shí)候會(huì)促進(jìn)神經(jīng)變性的發(fā)生。
　　因此，我們研究在TDP-43轉(zhuǎn)染的NSC-34的細(xì)胞的肌萎縮側(cè)

6、索硬化模型中，EGCG對(duì)自噬的影響，從而探討EGCG是否對(duì)TDP-43相關(guān)的肌萎縮側(cè)索硬化的細(xì)胞模型有保護(hù)作用。
　　方法:本研究中使用了TDP-43轉(zhuǎn)染的NSC-34的細(xì)胞作為肌萎縮側(cè)索硬化細(xì)胞模型。用不同濃度和作用時(shí)間的綠茶多酚處理NSC34細(xì)胞后，通過CCK-8法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活力影響;采用恰當(dāng)?shù)臐舛燃皶r(shí)間的綠茶多酚干預(yù)NSC34細(xì)胞后，用western印跡技術(shù)檢測(cè)LC3-Ⅱ蛋白水平;GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用不同濃度的

7、綠茶多酚處理該細(xì)胞，采用免疫熒光技術(shù)觀察GFP-LC3點(diǎn)狀聚集的情況;用自噬通路阻斷劑BafilomycinA1處理細(xì)胞，然后通過western印跡技術(shù)觀察綠茶多酚是通過什么途徑影響LC3-Ⅱ蛋白水平;在肌萎縮側(cè)索硬化細(xì)胞模型即瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC-34的細(xì)胞中，選擇恰當(dāng)度的綠茶多酚干預(yù)后，用westernblot法檢測(cè)外源性TDP-43蛋白水平的影響。
　　結(jié)果:(1)依次用不同濃度(0-100μM)的綠茶多酚處理NSC

8、34細(xì)胞24h后，在0-20μM濃度范圍的綠茶多酚對(duì)細(xì)胞活力沒有明顯區(qū)別，在40-80μM之間的綠茶多酚據(jù)藥物濃度的逐漸增大，細(xì)胞毒性逐漸增加。在20μM的綠茶多酚處理下，處理0-36h后，細(xì)胞活力沒有明顯下降。
　　(2)依次用(0-20μM)不同濃度的綠茶多酚處理NSC34細(xì)胞24h后，用westernblot法檢測(cè)，結(jié)果表明LC3-Ⅱ的水平逐漸升高;分別用20μM的綠茶多酚處理NSC34細(xì)胞不同時(shí)間(0-36h)后，West

9、ernblot檢測(cè)結(jié)果表明，LC3-Ⅱ的水平在處理24h后是最高的;用免疫熒光技術(shù)觀察GFP-LC3點(diǎn)狀聚集，結(jié)果表明攜帶GFP-LC3點(diǎn)狀聚集的細(xì)胞數(shù)目在處理24h內(nèi)是依綠茶多酚濃度增加而逐漸增多的。
　　(3)給予自噬通路阻斷劑BafilomycinA1阻斷處理，及給予20μM的綠茶多酚處理24h后，western印跡檢測(cè)結(jié)果表明，綠茶多酚在BafilomycinA1存在的情況下，LC3-Ⅱ的水平顯著升高。結(jié)果表明綠茶多酚是通