肌肉萎縮性側索硬化癥相關的致病蛋白TDP-43降解機制的研究.pdf

1、神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一類慢性的神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，主要因腦中特定神經(jīng)元的壞死和退變引起的。大多數(shù)的神經(jīng)退行性疾病都有一個共同的特征：在病人的腦中，突變的蛋白在細胞外或細胞內(nèi)異常的聚集，形成聚集體或包涵體。例如，與肌肉萎縮性側索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis，簡稱ALS)相關的致病蛋白TAR DNAbinding protein-43(TDP-43)，在病人

2、的腦細胞內(nèi)被檢測到突變的TDP-43蛋白形成的聚集體等。
　　 肌肉萎縮性側索硬化癥是神經(jīng)退行性疾病的一種。分為家族遺傳性和散發(fā)性兩種?；蜓芯恳汛_定常染色體顯性遺傳型與銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變有關，這些基因突變患者僅占家族遺傳性病例的20％。TDP-43是最近發(fā)現(xiàn)的一個與遺傳性和散發(fā)性ALS以及其他一些神經(jīng)退行性疾病發(fā)病相關的蛋白，目前TDP-43蛋白被認為是除SOD1外引起ALS的一種主要致病蛋白。突變的TD

3、P-43蛋白在細胞的胞漿中形成泛素化的聚集。這個聚集被認為是有毒性的，它可能導致神經(jīng)元的死亡，攜帶突變TDP-43基因的轉基因鼠具有與人類ALS極為相似的癥狀。因此對TDP-43蛋白降解機制的研究對我們研究ALS的發(fā)病機制有著重要的意義。
　　 本文主要通過對野生型的TDP-43蛋白和病理突變的25KD的TDP一43(TDP-25)蛋白的降解途徑進行探討，揭示了其具體降解途徑，主要研究結果如下：
　　 我們先將與綠色熒光

4、蛋白相嵌合的野生型的TDP-43蛋白(GFP-TDP-43)和病理突變的TDP-43蛋白(GFP-TDP-25)分別轉染到HEK293細胞中，用MG132處理后，將細胞收集下來檢測TDP-43和病理突變的TDP-25的蛋白量的變化。我們發(fā)現(xiàn)：加了MG132的實驗組，其蛋白降解受到抑制，且病理突變的TDP-25的現(xiàn)象遠比野生型的TDP-43蛋白明顯，同時，內(nèi)源性的TDP-43蛋白降解也受到影響。另外，免疫共沉淀的結果顯示，病理突變的TDP

5、-25的泛素化程度比野生型的TDP-43強。細胞免疫熒光化學的結果也顯示，MG132處理后，TDP-43和病理突變的TDP-25在細胞內(nèi)的聚集都明顯增加。說明野生型的TDP-43和病理突變的TDP-25都可以通過泛素蛋白酶體途徑降解。
　　 在細胞內(nèi)，我們發(fā)現(xiàn)溶酶體標志蛋白，LC3(RFP-LC3)與GFP-TDP-25有共定位的現(xiàn)象。這提示我們TDP-43蛋白可能通過溶酶體途徑降解。
　　 為了進一步揭示野生型的TDP

6、-43和TDP-25是否通過溶酶體途徑降解，我們分別用溶酶體降解途徑的抑制劑3-MA/pepstaineA和促進劑Trehalose處理，發(fā)現(xiàn)3-MA/pepstaineA處理后，蛋白降解受到抑制，且TDP-25遠比野生型的TDP-43明顯。同時，Trehalose處理后，蛋白降解加快，TDP-25降解比TDP-43明顯。
　　 通過以上實驗，我們得出結論：野生型的TDP-43和病理突變的TDP-25既能通過泛素蛋白酶體途徑降解