線粒體自噬在肌萎縮側(cè)索硬化癥中的相關(guān)研究以及大蒜素的神經(jīng)保護(hù)作用的機制探討.pdf

1、背景:肌萎縮側(cè)索硬化[Amyotrophiclateralsclerosis，(ALS)]，是一個致死性的神經(jīng)變性疾病，臨床表現(xiàn)為肌萎縮，肌強直，無力等。通常在診斷后的3-5年就可以死亡。最近，在ALS和伴有泛素陽性包涵體的額顳葉癡呆病人[frontotemporallobardementiawithubiquitin-positiveinclusions，(FTLD-U)]的腦中發(fā)現(xiàn)了泛素化的包涵體，其中TDP-43是主要的組成成分。

2、所以，TDP-43在神經(jīng)變性疾病中受到越來越多的人的關(guān)注。TDP-43，它是普遍存在的核蛋白，由414個氨基酸組成。它是由1號染色體上的TARDBP基因編碼的。它的作用包括了特異性前RNA的剪切和轉(zhuǎn)錄，信使RNA的穩(wěn)定性以及小RNA的生物發(fā)生等。至今，已在散發(fā)和遺傳性的ALS病人的TDP-43基因中發(fā)現(xiàn)40多種的顯性突變，就為TDP-43功能異常和變性疾病中提供了直接的證據(jù)。TDP-43的發(fā)現(xiàn)為我們研究ALS和FTLD-U的發(fā)病機制開拓

3、了新的視野。在ALS的發(fā)病機制中，線粒體是多個發(fā)病機制的匯合點。大量的研究表明在突變的SOD1相關(guān)的ALS的病人，細(xì)胞以及動物模型中，線粒體損傷參與了發(fā)病機制過程。其中突變和野生型的SOD1在線粒體上聚集是一個非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。相對應(yīng)的是在轉(zhuǎn)染TDP-43的細(xì)胞中，同樣存在線粒體膜電位的降低，ROS的生成增多以及呼吸鏈的受損等線粒體損傷的證據(jù)。線粒體選擇性的自噬在線粒體的質(zhì)量控制機制中發(fā)揮著重要的作用，它參與了帕金森病、阿爾茨海默病的發(fā)病

4、機制。但是在ALS的模型中，研究的卻非常少。
　　 大蒜素，它是大蒜油中有機硫化合物的主要成分，由于其強大的抗癌效應(yīng)受到越來越多的關(guān)注。在動物模型中，它不但可以通過多種機制保護(hù)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的癌癥，抗癌機制包括調(diào)控致癌物的代謝，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來阻止腫瘤細(xì)胞的增長，誘導(dǎo)凋亡，組氨酸的修飾，抑制血管的再生。大蒜素其他的健康益處包括抗血栓效應(yīng)，改善免疫功能，降低血糖，防止輻射和微生物的侵入。另外，其神經(jīng)保護(hù)作用在ALS的脊髓培養(yǎng)模型

5、和SOD1的轉(zhuǎn)基因鼠中均得到驗證，但是在ALS的細(xì)胞模型中的療效卻沒有證實。
　　 第一部分過表達(dá)TDP-43及其片段對線粒體的功能和形態(tài)的影響
　　 目的:本研究的目的是探討TDP-43及其片段對線粒體的功能和形態(tài)的影響。
　　 方法:在NSC34細(xì)胞中瞬時表達(dá)含有空質(zhì)粒對照、野生型、Q331K、M337V、TDP-25和TDP-35的質(zhì)粒。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞并用western印跡驗證細(xì)胞的表達(dá)效率;

6、用免疫熒光觀察外源性蛋白的分布特點;用流式細(xì)胞計數(shù)觀察TDP-43及其片段對線粒體膜電位和活性氧簇的影響;用免疫熒光觀察外源性蛋白對線粒體形態(tài)的影響。
　　 結(jié)果:(1)在NSC34細(xì)胞中可以順利表達(dá)外源性的TDP-43蛋白。并且表達(dá)全長的TDP-43蛋白水平和內(nèi)源性TDP-43蛋白水平差不多，表達(dá)片段的TDP-43水平大約是內(nèi)源性TDP-43蛋白水平的一半。
　　 (2)在對照細(xì)胞中，內(nèi)源性的TDP-43主要在胞核中。

7、在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，全長的TDP-43蛋白主要分布在胞核中，一部分在胞漿中存在。而片段化的TDP-43更容易形成在胞核和胞漿致密的包涵體。
　　 (3)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，表達(dá)全長及片段的TDP-43細(xì)胞和空質(zhì)粒對照的細(xì)胞相比，線粒體的膜電位降低了，活性氧簇的水平明顯上升。
　　 (4)通過激光共聚焦顯微鏡觀察，轉(zhuǎn)染全長及片段的TDP-43的細(xì)胞中，線粒體的分布不均勻和聚集更多見。
　　 結(jié)論:表達(dá)全長及片段

8、TDP-43的NSC34細(xì)胞和對照細(xì)胞相比，明顯降低了線粒體膜電位的水平，提高了活性氧簇的水平，并且干擾了線粒體的正常分布。
　　 第二部分過表達(dá)TDP-43及其片段對線粒體自噬的影響
　　 目的:本研究的目的是探討TDP-43及其片段對線粒體自噬的影響。
　　 方法:在NSC34細(xì)胞中瞬時表達(dá)含有空質(zhì)粒對照、野生型、Q331K、M337V、TDP-25和TDP-35的質(zhì)粒。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，用勻漿器離心方法提

9、取胞漿和線粒體組分，然后用透射電鏡和Western印跡檢測提取線粒體的純度和形態(tài);并用Western印跡技術(shù)檢測各組分外源性和內(nèi)源性TDP-43的表達(dá)，用免疫熒光觀察外源性TDP-43和線粒體的分布關(guān)系，用western印跡技術(shù)檢測線粒體和胞漿中LC3B、P62的蛋白水平。
　　 結(jié)果:(1)用透射電鏡技術(shù)檢測提取的線粒體形態(tài)保存尚好，純度約在90％以上。用western印跡檢測線粒體部分的標(biāo)記物VDAC1和胞漿部分的標(biāo)記物ac

10、tin，彼此并不摻雜，說明提取線粒體的純度高。
　　 (2)用western印跡檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中胞漿和線粒體部分的外源性TDP-43，在線粒體上可有少量的外源性TDP-43的存在，而且野生型和突變型的水平差不多。用免疫熒光檢測結(jié)果表明，外源性TDP-43可以和線粒體的標(biāo)記物共定位。
　　 (3)用western印跡分別檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中胞漿和線粒體部分的外源性TDP-43、內(nèi)源性TDP-43、LC3B、P62的蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染全

11、長TDP-43細(xì)胞比空質(zhì)粒對照細(xì)胞中，線粒體部分的內(nèi)源性TDP-43的表達(dá)明顯升高，LC3B蛋白水平明顯升高，P62的蛋白水平顯著降低。在轉(zhuǎn)染片段的TDP-43的細(xì)胞中，線粒體外膜蛋白VDAC1的水平降低，而線粒體部分的LC3B蛋白水平明顯升高，P62的蛋白水平顯著降低。
　　 結(jié)論:勻漿離心法提取的線粒體形態(tài)完整，純度高;外源性TDP-43在線粒體部分少量存在;轉(zhuǎn)染外源性TDP-43的細(xì)胞，LC3B蛋白水平明顯升高，P62的蛋

12、白水平顯著降低，激活了線粒體自噬。
　　 第三部分大蒜素在肌萎縮側(cè)索硬化模型中神經(jīng)保護(hù)作用機制的探討
　　 目的:本研究的目的是探討大蒜素在肌萎縮側(cè)索硬化模型中的神經(jīng)保護(hù)作用和機制。
　　 方法:用CCK-8法檢測不同濃度和時間的大蒜素處理的NSC34細(xì)胞后，對細(xì)胞活力影響;采用合適的濃度及時間的大蒜素干預(yù)NSC34細(xì)胞后，用western印跡技術(shù)檢測LC3B蛋白水平;在轉(zhuǎn)染攜帶GFP-LC3質(zhì)粒的細(xì)胞中，在不同

13、濃度的大蒜素處理后，用免疫熒光技術(shù)觀察GFP-LC3點狀聚集的情況;在轉(zhuǎn)染TDP-43的細(xì)胞中，選擇合適濃度的大蒜素干預(yù)后，用western印跡技術(shù)檢測外源性TDP-43變化;分別選用自噬通路阻斷劑(BafilomycinA1)和蛋白酶體通路阻斷劑(MG132)處理細(xì)胞，觀察大蒜素是通過什么途徑影響蛋白水平;在轉(zhuǎn)染TDP-43的細(xì)胞中，選擇合適濃度的大蒜素干預(yù)后，用Western印跡技術(shù)檢測胞核部分Nrf2的表達(dá)情況與細(xì)胞中抗氧化酶的表

14、達(dá)水平。
　　 結(jié)果:(1)分別用不同濃度(0-100μM)的大蒜素處理NSC34細(xì)胞24h后，在0-10μM的大蒜素對于細(xì)胞活力沒有明顯區(qū)別，在20-100μM之間的大蒜素依據(jù)藥物濃度逐漸增大，細(xì)胞毒性逐漸增加。在10μM的大蒜素處理下，處理48h后，細(xì)胞活力明顯下降。
　　 (2)分別用不同濃度(0-10μM)的大蒜素處理NSC34細(xì)胞24h后，用western印跡檢測結(jié)果表明，LC3-Ⅱ的水平是逐漸升高;分別用10

15、μM的大蒜素處理NSC34細(xì)胞不同時間(0-36h)后，Western印跡檢測結(jié)果表明，處理24h后，LC3-Ⅱ的水平是最高的;用免疫熒光技術(shù)觀察GFP-LC3點狀聚集，結(jié)果表明在處理24h后，攜帶點狀聚集的細(xì)胞數(shù)目是依濃度增加而逐漸最多的。
　　 (3)在NSC34細(xì)胞中瞬時表達(dá)含有空質(zhì)粒對照、野生型、Q331K、M337V、TDP-25和TDP35的質(zhì)粒，給予10μM的大蒜素處理24h后，Western印跡檢測結(jié)果表明，外源

16、性TDP-43水平都有顯著的下降;給予自噬通路阻斷劑(BafilomycinA1)和蛋白酶體通路阻斷劑(MG132)阻斷處理后，western印跡檢測結(jié)果表明，大蒜素在BafilomycinA1存在的情況下，不能降解TDP-25蛋白水平，而在MG132存在的情況下，仍然可以降解。結(jié)果表明大蒜素是通過自噬途徑來促進(jìn)蛋白的降解。
　　 (4)在NSC34細(xì)胞中瞬時表達(dá)含有空質(zhì)粒對照、野生型、Q331K、M337V、TDP-25和TD