抗凝蛋白活性參考物質(zhì)研制及結(jié)果一致化相關(guān)問題研究.pdf

1、目的:抗凝血酶、蛋白C、蛋白S活性檢測(cè)可用于遺傳性易栓癥的診斷與分型，也可用于獲得性易栓癥的診斷及預(yù)后判斷。目前抗凝血酶、蛋白C、蛋白S活性檢測(cè)無國(guó)際公認(rèn)的參考方法，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品不易獲得，不同檢測(cè)系統(tǒng)間結(jié)果差異不明確，且目前國(guó)內(nèi)無抗凝蛋白檢測(cè)規(guī)范化操作指南，影響了其在臨床的應(yīng)用價(jià)值。本研究通過問卷對(duì)目前國(guó)內(nèi)抗凝血酶、蛋白C、蛋白S活性檢測(cè)現(xiàn)狀及存在的問題進(jìn)行調(diào)查;嘗試研制候選參考物質(zhì)并對(duì)其均勻性、穩(wěn)定性、互通性進(jìn)行評(píng)價(jià)并定值;對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的

2、性能驗(yàn)證、不同檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果的比對(duì)、校準(zhǔn)模式等結(jié)果一致化相關(guān)問題進(jìn)行研究，為促進(jìn)抗凝血酶、蛋白C、蛋白S活性檢測(cè)結(jié)果一致化及質(zhì)量改進(jìn)提供依據(jù)。
　　方法:1.檢測(cè)現(xiàn)狀的調(diào)查研究:通過發(fā)放調(diào)查問卷，收集國(guó)內(nèi)開展AT、PC、PS檢測(cè)項(xiàng)目的臨床實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢測(cè)信息，包括使用儀器、試劑、方法學(xué)信息，性能驗(yàn)證，標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及參考區(qū)間的設(shè)定，室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)情況等，與國(guó)外相關(guān)指南文件的要求進(jìn)行比較，明確檢測(cè)現(xiàn)狀和存在問題，并針對(duì)性地提出改進(jìn)措

3、施建議。
　　2.候選參考物質(zhì)的研制與評(píng)價(jià):選擇合適的原料和制備方法，利用新鮮血漿制備2個(gè)批次3～5個(gè)批號(hào)的候選參考物質(zhì)。依據(jù)ISO Guide35《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值——通用原則和統(tǒng)計(jì)原理》，CNAS-GL03《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》，NCCLS EP14-A《基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)指南》的要求，對(duì)候選參考物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性、互通性進(jìn)行評(píng)價(jià)。依據(jù)ISO Guide35選取不同檢測(cè)系統(tǒng)的8家實(shí)驗(yàn)室，以NIBSC凝血標(biāo)準(zhǔn)

4、物質(zhì)LOT4為溯源標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定值。將候選參考物質(zhì)試應(yīng)用于室內(nèi)質(zhì)控，同時(shí)檢測(cè)進(jìn)口商品質(zhì)控物作為比較。
　　3.檢測(cè)結(jié)果一致化相關(guān)問題研究:①參考國(guó)外文獻(xiàn)及指南文件，結(jié)合廠家建議及專家意見制訂性能驗(yàn)證方案，對(duì)Stago STA-R evolution全自動(dòng)血凝儀AT、PC、PS活性檢測(cè)的批內(nèi)精密度、日間精密度、準(zhǔn)確度、攜帶污染率、線性進(jìn)行驗(yàn)證;②依據(jù)EP9-A2利用臨床標(biāo)本對(duì)3種常用AT、PC、PS活性檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)間的比對(duì)

5、，明確系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果的差異并進(jìn)行校準(zhǔn)模式探討。
　　結(jié)果:1.檢測(cè)現(xiàn)狀的調(diào)查研究:調(diào)查結(jié)果顯示國(guó)內(nèi)的抗凝蛋白檢測(cè)以活性檢測(cè)為主，AT活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室最多（102家），PC和PS活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室數(shù)量較少（36家和31家），僅個(gè)別實(shí)驗(yàn)室開展抗凝蛋白抗原檢測(cè)。各實(shí)驗(yàn)室普遍采用儀器法進(jìn)行抗凝蛋白活性檢測(cè)，最常用的檢測(cè)系統(tǒng)為希森美康(Sysmex)、思塔高(Stago)和沃芬(instrument labortary, IL)及其配套試劑;各實(shí)

6、驗(yàn)室定標(biāo)頻率不同，對(duì)于AT、PC和PS分別有40.2％、33.3％和32.3％的實(shí)驗(yàn)室在質(zhì)控失控時(shí)定標(biāo)，另有16.1％的實(shí)驗(yàn)室在每批次PS活性檢測(cè)前定標(biāo);各實(shí)驗(yàn)室使用的參考區(qū)間不盡相同，僅59.8％的實(shí)驗(yàn)室對(duì)參考區(qū)間進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)于PS僅5家（占16.1％）實(shí)驗(yàn)室使用按性別區(qū)分的參考區(qū)間;約42％的實(shí)驗(yàn)室未進(jìn)行儀器性能驗(yàn)證;約15％的實(shí)驗(yàn)室不常規(guī)開展室內(nèi)質(zhì)控;對(duì)于AT、PC、PS分別有85.7％、75.0％和71.0％的實(shí)驗(yàn)室未參加任何形

7、式的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)。
　　2.候選參考物質(zhì)的研制:采用新鮮冰凍血漿為原料，緩沖液稀釋法調(diào)整AT、PC、PS活性水平，分裝成1.0ml/支置于-80℃冷凍條件下保存，最終制備出第1批次3個(gè)批號(hào)，第2批次3～5個(gè)批號(hào)(批號(hào)分別為AT/PC/PS201401～201403，AT201501～201503，PC/PS201501～201505)活性水平范圍可控的候選參考物質(zhì)。候選參考物質(zhì)均勻性良好，評(píng)價(jià)結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05

8、);復(fù)融后在室溫和冷藏條件下3種抗凝蛋白活性穩(wěn)定時(shí)間分別為24h和24h、8h和12h、3h和12h;長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)價(jià)線性回歸分析顯示AT和PC活性檢測(cè)各批次各濃度水平候選參考物質(zhì)在24周觀察期內(nèi)穩(wěn)定，正常濃度PS活性檢測(cè)候選參考物質(zhì)可穩(wěn)定19周，異常低濃度PS活性檢測(cè)候選參考物質(zhì)可穩(wěn)定15周(P＞0.05);各批號(hào)候選參考物質(zhì)在3種檢測(cè)系統(tǒng)間均具有互通性;AT201501～AT201503批號(hào)候選參考物質(zhì)的定值結(jié)果分別為:101.4±7

9、.53、72.3±6.25和41.5±4.98;PC201501～PC201505批號(hào)候選參考物質(zhì)的定值結(jié)果分別為:96.3±6.45、116.1±6.88、77.3±3.58、47.5±3.62和29.1±2.72; PS201501～PS201505批號(hào)候選參考物質(zhì)的定值結(jié)果分別為:95.1±20.62、103.2±20.71、60.6±8.37、33.7±9.63和18.2±9.58。室內(nèi)質(zhì)控試應(yīng)用結(jié)果顯示，候選參考物質(zhì)和商品質(zhì)控

10、品AT、PC和PS檢測(cè)結(jié)果CV分布范圍分別為3.02～7.39％和4.28～9.37％;3.11～4.88％和3.95～5.22％;3.53～5.88％和5.72～5.74％，均小于廠家規(guī)定的批間不精密度。
　　3.檢測(cè)結(jié)果一致化相關(guān)問題研究:①性能驗(yàn)證結(jié)果顯示AT、PC、PS活性檢測(cè)批內(nèi)及日間精密度均在廠家要求范圍內(nèi);準(zhǔn)確度驗(yàn)證與NIBSC凝血標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)靶值間的偏倚分別為-1.09％、9.78％和-3.09％;攜帶污染率分別為1.

11、37％、0.0％和2.15％;線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，AT活性檢測(cè)在23～128％區(qū)間內(nèi)線性驗(yàn)證通過，PC活性檢測(cè)在30～150％區(qū)間內(nèi)線性驗(yàn)證通過，PS活性檢測(cè)在25～126％區(qū)間內(nèi)線性驗(yàn)證通過。②可比性研究結(jié)果顯示對(duì)于AT活性檢測(cè)，兩兩檢測(cè)系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性和可比性可接受;對(duì)于PC活性檢測(cè)，兩兩檢測(cè)系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性和可比性好;對(duì)于PS活性檢測(cè)，第1批次可比性評(píng)價(jià)結(jié)果IL與Sysmex兩系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性可接受，

12、Stago與上述兩系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性好，兩兩檢測(cè)系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果可比性可接受，第2批次可比性評(píng)價(jià)IL與 Sysmex兩系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性可接受，Stago與上述兩系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性差，兩兩檢測(cè)系統(tǒng)間檢測(cè)結(jié)果可比性差。使用LOT4模擬定標(biāo)曲線將比對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，AT活性檢測(cè)IL與Sysmex系統(tǒng)間差異略減小，Stago與另外兩系統(tǒng)間差異增大;PC活性檢測(cè)IL與另外兩系統(tǒng)間差異略減小，Stago與Sysmex系統(tǒng)間差異增大;P

13、S活性檢測(cè)2次系統(tǒng)間可比性結(jié)果均呈增大趨勢(shì)。
　　結(jié)論:1.問卷調(diào)查結(jié)果顯示與國(guó)外相關(guān)技術(shù)指南的要求進(jìn)行比較，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室在抗凝蛋白活性檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)質(zhì)量控制方面仍有較大的改進(jìn)空間，應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員進(jìn)行系統(tǒng)化技術(shù)操作、定標(biāo)、參考區(qū)間驗(yàn)證、性能驗(yàn)證及質(zhì)量控制培訓(xùn)，并開展室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。
　　2.利用新鮮冰凍血漿制備AT，PC和PS候選參考物質(zhì)，其均勻性和穩(wěn)定性良好，在3種主流檢測(cè)系統(tǒng)間具有互通性，并完成了8家實(shí)驗(yàn)室包含3種主

14、流檢測(cè)系統(tǒng)的聯(lián)合定值。候選參考物質(zhì)與商品質(zhì)控物室內(nèi)質(zhì)控試應(yīng)用CV及變化趨勢(shì)具有可比性，表明其可以應(yīng)用于日常室內(nèi)質(zhì)控。
　　3.①對(duì)我室規(guī)范操作檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果符合廠家及相關(guān)文件的要求，性能驗(yàn)證方案可為其他檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證提供參考。②對(duì)于AT活性檢測(cè)具體的不同試劑間診斷敏感性差異還需進(jìn)一步選擇有明確ATⅡ型Cambridge缺陷和Ⅱ型HBS缺陷患者的血漿加以比對(duì);對(duì)于PC活性檢測(cè)3種系統(tǒng)的精密度，可比性及相關(guān)性均較好