布魯氏菌疫苗株流產(chǎn)相關(guān)因子Omp25蛋白與宿主胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞相互作用的研究.pdf

1、布魯氏菌?。╞rucellosis）(以下簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌（brucella）引起的人、畜共患傳染病，廣泛分布于世界各地。布魯氏菌病對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)建設(shè)、人民健康生活、國(guó)家安全等存在著嚴(yán)重的威脅。
　　 布病的病原為布魯氏菌，是一種胞內(nèi)寄生菌。它的致病機(jī)制以胞內(nèi)生存為主要特征。
　　 研究表明，動(dòng)物胎盤是布魯氏菌生存、繁殖的嗜好區(qū)域之一。胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞是布魯氏菌感染的靶細(xì)胞，一旦被破壞，容易引起流產(chǎn)，但是其分子機(jī)制目前還

2、不清楚。因此，以布魯氏菌和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞為研究對(duì)象具有重要意義。本研究主要包括以下幾方面內(nèi)容：
　　 ⑴流產(chǎn)布魯氏菌S19 omp25基因Bait載體的構(gòu)建及鑒定。通過(guò)對(duì)流產(chǎn)布魯氏菌S19 omp25基因進(jìn)行克隆、連接、酶切、純化等實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-omp25并將其轉(zhuǎn)化到釀酒酵母Y187 中，通過(guò)酵母自激活實(shí)驗(yàn)和毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)化子釀酒酵母Y187（pGBKT7-omp25）的構(gòu)建。經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序表明成功構(gòu)建了

3、pGBKT7-omp25真核表達(dá)載體，獲得的轉(zhuǎn)化子酵母Y187 菌株無(wú)自激活活性，無(wú)毒性。
　　 ⑵流產(chǎn)布魯氏菌S19 侵染TGC細(xì)胞后提取總RNA 構(gòu)建cDNA 文庫(kù)。首先用布魯氏菌S19 侵染牛胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞（TGC）3.5h 后提取Total RNA,用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA,采用同源重組技術(shù)構(gòu)建布魯氏菌S19 侵染TGC細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，即pGADT7-cDNA 并將其轉(zhuǎn)化到釀酒酵母AH109中，經(jīng)鑒定，cDNA文庫(kù)

4、庫(kù)容為1.30×106，重組效率為96.0％，插入片段大小在0.2-2.0kb之間。
　　 ⑶酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)，將釀酒酵母AH109（pGADT7-cDNA）和Y187（pGBKT7-omp25）進(jìn)行雜交并將陽(yáng)性雜交子進(jìn)行搖菌、提質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化DH5α、PCR等實(shí)驗(yàn)鑒定。最后送交測(cè)序并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。測(cè)序結(jié)果表明，篩選出與流產(chǎn)布魯氏菌流產(chǎn)相關(guān)因子Omp25相互作用的TGC細(xì)胞的靶蛋白共16個(gè)。
　　 ⑷

5、Q-RT-PCR實(shí)驗(yàn)。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)獲得16個(gè)蛋白基因序列，對(duì)其中2個(gè)基因設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)兩種特異結(jié)合蛋白的mRNA的增減規(guī)律，進(jìn)一步分析與S19、RB51的Omp25蛋白相互作用的滋養(yǎng)層細(xì)胞靶蛋白。結(jié)果表明RB51 侵染TGC細(xì)胞后，TMED1和clusterin基因的量均增加，而S19 侵染TGC細(xì)胞后，TMED1基因增加，clusterin基因的量降低。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，成功地構(gòu)建了流產(chǎn)布魯氏菌S19 omp25基因B