Restin與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的研究.pdf

1、該文利用細胞雙雜交技術(shù),對Restin在細胞周期中可能的作用的轉(zhuǎn)錄因子進行了篩選:一、首先從Gene Bank中篩選了31個與細胞周期密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,設(shè)計了特異性引物.從胎兒組織和刺激后的淋巴細胞中克隆了這些轉(zhuǎn)錄因子并構(gòu)建于細胞雙雜交系統(tǒng)的pACT質(zhì)粒中.這些轉(zhuǎn)錄因子與細胞的增殖、分化、應(yīng)激、調(diào)亡相關(guān),它們可以獨立或經(jīng)修飾或和配體分子相互作用而參與細胞周期的調(diào)控.最后我們得到6個編碼氨基酸正確的轉(zhuǎn)錄因子:ATF3、ATF4、E2F6

2、、C-JUN、C-FOS、p53.二、完整的誘餌蛋白Restin基因克隆在細胞雙雜交系統(tǒng)的pBIND質(zhì)粒中.首先對構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄因子(pACT-TFs)質(zhì)粒和誘餌(pBIND-restin)質(zhì)粒進行檢測有無自激活現(xiàn)象,通過與雙雜交陽性對照相比較,證明所構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后沒有出現(xiàn)自激活現(xiàn)象,可以進行雙雜交篩選;隨后將pBIND-restin和六種pACT-TFs3進行雙雜交,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATF3與Restin表現(xiàn)出強烈的相互作用,其余五個轉(zhuǎn)錄因子不

3、與Restin發(fā)生相互作用.三、為了進一步驗ATF3與Restin的相互作用,對ATF3進行截斷并構(gòu)建了一系列ATF3的截短片段的雙雜交質(zhì)粒(仍然構(gòu)建于pACT載體中),再次運用細胞雙雜交進行相互作用的探索.所構(gòu)建的質(zhì)粒為:pACT-ATF3-AD(轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)、pACT-ATF3-BD(DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、pACT-△ ATF3(含全部轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和部分DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域N端)、pACT-ATF3-△ BD(含有不完整的DNA結(jié)合

4、結(jié)構(gòu)域C端).構(gòu)建的截斷片段與Restin和螢火蟲熒光酶報告基因共轉(zhuǎn)染COS-7細胞24小時后檢測熒光酶活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Restin與ATF3的確存在相互作用,并作用于ATF3的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,不完整的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域降低了Restin與ATF3相互作用能力,進一步證實了Restin與ATF3相互作用.ATF3是在組織或細胞生理壓力性誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)中最早表達的轉(zhuǎn)錄因子.一方面,ATF3可以誘導(dǎo)細胞從靜止期進入細胞周期;另一方面它阻止毒性物