擬南芥轉(zhuǎn)錄因子TCP2與CRY1相互作用的遺傳學(xué)與生化分析.pdf

1、光通過(guò)多種光受體調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，這些光受體包含光敏色素與隱花色素。擬南芥隱花色素CRY1(CRYPTOCHROME1)作為藍(lán)光信號(hào)受體蛋白，已有許多的研究報(bào)道了其在植物藍(lán)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑方面的功能，如抑制下胚軸的伸長(zhǎng)，控制幼苗的去黃化、生物鐘節(jié)律，促進(jìn)植物花青素的積累，影響葉片形態(tài)和開花時(shí)間等。CRY1蛋白通過(guò)與其下游的信號(hào)蛋白相互作用，啟動(dòng)藍(lán)光信號(hào)的傳遞，從而促進(jìn)植物光形態(tài)的建成。目前光受體調(diào)節(jié)光形態(tài)建成的機(jī)制已得到廣泛的研究，但是

2、擬南芥隱花色素CRY1調(diào)節(jié)光形態(tài)建成的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制目前仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)了許多參與CRY1藍(lán)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并相互作用的蛋白，但轉(zhuǎn)錄因子蛋白參與CRY1藍(lán)光信號(hào)通路的研究報(bào)道目前幾乎沒(méi)有。為了更好地了解和完善CRY1藍(lán)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，本研究通過(guò)酵母雙雜交的方法，用CRY1作為誘餌篩選轉(zhuǎn)錄因子酵母庫(kù)，獲得與CRY1相互作用并可能介導(dǎo)CRY1參與擬南芥光形態(tài)建成的轉(zhuǎn)錄因子蛋白。具體研究結(jié)果如下:
　　通過(guò)多次的酵母雙雜交(yeast two

3、 hybrid assay)試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證以及雙分子熒光互補(bǔ)BiFC（Bimolecular Fluorescence Complementation assay）和免疫共沉淀 co-IP(co-immunoprecipitation)試驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證，證明CRY1與初步篩選到的轉(zhuǎn)錄因子蛋白TCP2(TEOSINTE-LIKE1, CYCLO IDEA, and PROLIFERATING CELL FACTOR2)相互作用。通過(guò)煙草和擬

4、南芥中亞細(xì)胞定位試驗(yàn)，證明TCP2是一個(gè)核蛋白，其可能是與細(xì)胞核中的CRY1蛋白相互作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)并證明了與CRY1直接相互作用的轉(zhuǎn)錄因子蛋白-TCP2，其相互作用在酵母細(xì)胞以及煙草細(xì)胞中表現(xiàn)出明顯的藍(lán)光特異性，而在擬南芥細(xì)胞中其藍(lán)光特異性依賴特征消失，推測(cè)可能是由于酵母及煙草系統(tǒng)中無(wú)擬南芥蛋白，而實(shí)際相互作用中可能存在其他擬南芥蛋白參與CRY1與TCP2的相互作用。
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析CRY1與TCP2的蛋白結(jié)構(gòu)域，分

5、段克隆CRY1和TCP2的多個(gè)結(jié)構(gòu)域片段并通過(guò)酵母雙雜交以及BiFC的方法，證明CRY1N端結(jié)構(gòu)域(該結(jié)構(gòu)域包含1-515的氨基酸序列，涵蓋了光裂解酶結(jié)構(gòu)域PHR)能與TCP2的特征結(jié)構(gòu)域TCP（該區(qū)域包含TCP21-174氨基酸序列）相互作用。TCP結(jié)構(gòu)域中的R結(jié)構(gòu)域影響其與CRY1在酵母細(xì)胞中相互作用的藍(lán)光依賴性。
　　遺傳學(xué)研究結(jié)果表明，TCP2藍(lán)光依賴性地抑制擬南芥下胚軸的伸長(zhǎng)，這種藍(lán)光特異性不僅表現(xiàn)在光波長(zhǎng)的特異性上還表

6、現(xiàn)為光強(qiáng)度的特異性依賴;其在紅光和藍(lán)光下能調(diào)控?cái)M南芥幼苗的子葉形態(tài)，而在遠(yuǎn)紅光下無(wú)此功能;其功能缺失突變體具有晚花的表型;我們的研究結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了TCP2蛋白調(diào)控葉片形態(tài)和大小方面的功能。
　　鑒于光作為環(huán)境影響因子在影響植物細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)以及CRY1在藍(lán)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上的重要性，我們研究了TCP2蛋白在缺失CRY1與否的情況下對(duì)于不同光響應(yīng)而做出的表達(dá)水平變化。通過(guò)免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)Myc-TCP2/WT和Myc-TCP2/

7、cry1轉(zhuǎn)基因材料中TCP2的蛋白變化，結(jié)果證明TCP2是一個(gè)光響應(yīng)的蛋白，其會(huì)在藍(lán)光下大幅積累而在黑暗和遠(yuǎn)紅光下降解，紅光下也會(huì)有積累但積累的量和速率遠(yuǎn)不及藍(lán)光下;同時(shí)，CRY1的缺失會(huì)影響到TCP2蛋白的穩(wěn)定以及積累速度。蛋白酶抑制劑MG132的處理結(jié)果表明，TCP2蛋白是通過(guò)26S蛋白酶體泛素化途徑降解。通過(guò)Luciferase assay測(cè)定翻譯抑制劑CHX處理下不同背景（包括WT、CRY1突變體cry1、cry1cry2雙突變

8、體和ZTL3突變體ztl3-1）中LUC-TCP2對(duì)藍(lán)光的響應(yīng)，結(jié)果證明TCP2在藍(lán)光下的積累是受到多個(gè)藍(lán)光受體的影響，且mRNA的翻譯量會(huì)影響到蛋白的積累，這也側(cè)面地證明不同藍(lán)光受體都會(huì)通過(guò)影響TCP2的mRNA的表達(dá)量影響TCP2蛋白的積累。
　　對(duì)于TCP2 mRNA光影響因子的研究結(jié)果表明，TCP2的mRNA表達(dá)量通過(guò)光特異性依賴的方式受到許多光受體的影響。TCP2作為一個(gè)核定位的轉(zhuǎn)錄因子蛋白正調(diào)控HY5、HYH、CAB和

9、CHS的mRNA的表達(dá)。RBSS(Radom binding sites selection)結(jié)果表明TCP2的DNA結(jié)合位點(diǎn)為GGGGNCC。另外ChIP-qPCR結(jié)果表明TCP2蛋白能藍(lán)光特異性結(jié)合HY5和HYH的啟動(dòng)子區(qū)域中的TCP2結(jié)合位點(diǎn)或相似性位點(diǎn)。以上結(jié)果表明TCP2作為轉(zhuǎn)錄因子作用于許多光受體的下游，其中就包括CRY1。
　　為了更好地研究CRY1與TCP2蛋白在植物內(nèi)的相互作用，本研究設(shè)計(jì)了一套雙基因載體pDTs

10、（pDT1、pDT7和pDT7G），以期通過(guò)一次植物轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)兩個(gè)蛋白的同時(shí)表達(dá)。本研究構(gòu)建多對(duì)基因至雙基因載體并轉(zhuǎn)入煙草或擬南芥中，通過(guò)定量、免疫印跡、熒光顯微鏡、免疫共沉淀、轉(zhuǎn)基因表型分析以及共表達(dá)效率分析試驗(yàn)分析雙基因載體的實(shí)用性，得到如下結(jié)果:(1)多對(duì)基因通過(guò)雙基因表達(dá)載體在植物細(xì)胞內(nèi)成功共表達(dá);(2)pDT7G載體上cGR實(shí)現(xiàn)了其核質(zhì)轉(zhuǎn)移功能;(3)共表達(dá)雙基因的生理生化功能未受影響;(4)雙基因載體能實(shí)現(xiàn)雙基因在植物細(xì)胞內(nèi)的