DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因CSB-PGBD3、MSH5和FMR1在卵巢早衰發(fā)病中的作用機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 中國(guó)漢族卵巢早衰家系的全外顯子組測(cè)序研究
　　目的:目前卵巢早衰的遺傳學(xué)研究主要依賴于模式動(dòng)物及散發(fā)性POF病例的基因突變篩查，但進(jìn)展緩慢?；蚪M學(xué)技術(shù)的發(fā)展為尋找疾病易感位點(diǎn)和候選基因提供了更高效精準(zhǔn)的手段，因此，本研究擬通過高覆蓋率的全外顯子組測(cè)序技術(shù)，以POF家系為研究對(duì)象，希望發(fā)現(xiàn)新的POF致病基因。
　　方法:在中國(guó)漢族非近親婚配家系POF-1中分別選取POF患

2、者、致病基因疑似攜帶者和非攜帶者，使用illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，所獲結(jié)果與hg19數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列對(duì)比，并按照常染色體顯性遺傳方式進(jìn)行候選基因篩選，然后在其他成員中通過Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，并在432例散發(fā)性POF患者和400例正常對(duì)照中進(jìn)行候選基因突變篩查。
　　結(jié)果:在POF-1家系的全外顯子組測(cè)序中，我們發(fā)現(xiàn)了符合常染色體顯性遺傳規(guī)律的錯(cuò)義突變PGBD3c.2237G＞A(p.G746D)。由于轉(zhuǎn)座子基因

3、PGBD3能夠插入CSB基因形成CSB-PGBD3融合基因，因此我們?cè)?32例散發(fā)性POF患者和400例正常對(duì)照中對(duì)CSB-PGBD3進(jìn)行了基因突變篩查，繼而又發(fā)現(xiàn)了雜合錯(cuò)義突變c.3166G＞A(p.V1056I)和雜合無義突變c.643G＞T(p.E215X)。
　　結(jié)論:首次發(fā)現(xiàn)CSB-PGBD3基因突變與家族性和散發(fā)性POF密切相關(guān)，為POF致病機(jī)制研究提供了新的方向。高通量的全外顯子組測(cè)序技術(shù)也為POF的遺傳學(xué)研究提供了

4、有力的技術(shù)支持。
　　第二部分 CSB-PGBD3基因突變對(duì)DNA損傷修復(fù)功能的影響
　　目的:通過對(duì)POF-1家系進(jìn)行全外顯子組測(cè)序研究，我們發(fā)現(xiàn)了POF候選致病基因CSB-PGBD3。PGBD3是靈長(zhǎng)類動(dòng)物特有的轉(zhuǎn)座子基因，它可以插入CSB基因形成CSB-PGBD3融合基因，并表達(dá)CSB-PGBD3融合蛋白。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CSB-PGBD3融合蛋白參與DNA損傷的轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)修復(fù)，但該基因在生殖細(xì)胞中的作用及其對(duì)卵巢功能的影響尚

5、無報(bào)道。本課題擬通過研究CSB-PGBD3融合蛋白在卵巢組織中的表達(dá)情況及突變對(duì)其DNA損傷修復(fù)功能的影響，探討CSB-PGBD3與卵巢早衰的關(guān)系及致病機(jī)制。
　　方法:利用人和恒河猴的卵巢組織對(duì)PGBD3和CSB-PGBD3融合蛋白進(jìn)行卵巢組織定位。通過clonogenic survival實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CSB-PGBD3基因突變對(duì)細(xì)胞存活的影響。通過laser irradiation和H2O2損傷實(shí)驗(yàn)明確CSB-PGBD3的DNA損

6、傷修復(fù)功能。通過對(duì)比野生型和突變型CSB-PGBD3與RNAPolⅡ等DNA損傷修復(fù)因子的相互作用，探討CSB-PGBD3參與DNA損傷修復(fù)的具體機(jī)制及突變對(duì)其功能的影響。
　　結(jié)果:通過在卵巢組織中的定位研究，我們發(fā)現(xiàn)PGBD3和CSB-PGBD3融合蛋白在靈長(zhǎng)類動(dòng)物各級(jí)卵泡的卵母細(xì)胞核中特異性表達(dá)。通過多種DNA損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)CSB-PGBD3能夠通過與RNApolⅡ結(jié)合，參與DNA損傷的轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)修復(fù)機(jī)制。此外，CSB

7、-PGBD3能夠上調(diào)XPA、DDB1等DNA損傷修復(fù)因子的表達(dá)，促進(jìn)更廣泛的DNA修復(fù)。我們所發(fā)現(xiàn)的3種突變均不同程度地影響了CSB-PGBD3的DNA損傷修復(fù)功能。
　　結(jié)論:CSB-PGBD3融合蛋白是卵母細(xì)胞重要的DNA損傷修復(fù)因子，CSB-PGBD3基因突變導(dǎo)致的卵母細(xì)胞DNA損傷修復(fù)功能障礙可能是POF的致病機(jī)制之一。
　　第三部分 DNA損傷修復(fù)因子MSH5在卵巢早衰發(fā)病中的作用機(jī)制研究
　　目的:MSH5

8、是重要的減數(shù)分裂相關(guān)基因，促進(jìn)同源重組過程中HollidayJunction的形成和穩(wěn)定，對(duì)第一次減數(shù)分裂前期聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形成和配子發(fā)生具有重要作用。本研究的目的是探討MSH5基因突變與卵巢早衰的相關(guān)性及其致病機(jī)制。
　　方法:通過對(duì)中國(guó)漢族非近親婚配家系POF-2進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，并在432例散發(fā)性POF患者中進(jìn)行驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)了MSH5基因突變。利用RT-PCR和免疫組化在人和恒河猴的卵巢組織中進(jìn)行MSH5表達(dá)定位;通過cl

9、onogenicsurvival實(shí)驗(yàn)檢測(cè)野生型和突變型MSH5蛋白對(duì)細(xì)胞存活的影響;利用依托泊苷(ETO)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂，并通過檢測(cè)γH2AX水平，分析突變對(duì)MSH5的DNA損傷修復(fù)功能的影響:同時(shí)，結(jié)合文獻(xiàn)信息和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型，分析MHS5基因突變對(duì)卵巢功能的影響及其在POF發(fā)病中的作用。
　　結(jié)果:通過對(duì)POF-2家系進(jìn)行全外顯子組測(cè)序研究，我們發(fā)現(xiàn)了位于MSH5基因的純合錯(cuò)義突變c.1459G＞T(p.D487

10、Y)，散發(fā)性POF患者中未發(fā)現(xiàn)該突變。通過蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型分析，我們發(fā)現(xiàn)突變p.D487Y位于MSH5的DNA結(jié)合功能域內(nèi)，該位點(diǎn)從酵母到人類高度保守，酵母的同源位點(diǎn)突變可嚴(yán)重影響孢子生成。通過在卵巢組織中的定位研究，我們發(fā)現(xiàn)MSH5蛋白不僅在胚胎期的卵巢組織中高表達(dá)，而且在發(fā)育期卵泡的卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中表達(dá)。野生型MSH5蛋白能夠促進(jìn)ETO誘導(dǎo)的DNA雙鏈損傷的修復(fù)，而突變型MSH5的功能喪失。
　　結(jié)論:MSH5

11、基因突變與家族性POF密切相關(guān)。MSH5廣泛表達(dá)于卵巢的卵母細(xì)胞及其支持細(xì)胞中，MSH5基因突變可能通過DNA同源重組修復(fù)機(jī)制障礙引起卵母細(xì)胞及其支持細(xì)胞的過度凋亡，卵泡異常閉鎖，最終導(dǎo)致卵巢早衰的發(fā)生。
　　第四部分 FMR1基因前突變與中國(guó)漢族卵巢早衰的相關(guān)性研究
　　目的:卵巢早衰的遺傳學(xué)病因有很大的地域和種族差異。FMR1基因前突變?cè)诟呒铀魃l(fā)性POF患者中的發(fā)生率為3.3％-6.7％，被認(rèn)為是POF的重要致病基因。

12、FMR1前突變攜帶者的后代容易發(fā)生FMR1全突變，導(dǎo)致脆性X綜合征的發(fā)生，因此POF患者被推薦進(jìn)行FMR1突變篩查。但是，F(xiàn)MR1前突變?cè)谥袊?guó)漢族POF人群中的攜帶情況尚無報(bào)道，F(xiàn)MR1突變篩查的必要性有待探討。因此，本研究擬通過在中國(guó)漢族POF患者中進(jìn)行FMR1基因突變篩查，明確FMR1前突變與中國(guó)漢族POF的相關(guān)性，為遺傳咨詢和生育指導(dǎo)提供理論依據(jù)。
　　方法:選取379例中國(guó)漢族散發(fā)性POF患者和402例正常對(duì)照參與實(shí)驗(yàn)，以

13、外周血基因組DNA為模版，使用熒光標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過毛細(xì)管電泳檢測(cè)FMR15'UTR的CGG重復(fù)次數(shù)。同時(shí)，分析閉經(jīng)年齡與FMR1基因CGG重復(fù)次數(shù)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:FMR1前突變?cè)谥袊?guó)漢族散發(fā)性POF患者中的發(fā)生率僅為0.5％(2/379)，遠(yuǎn)低于高加索人群。FMR1中間型（CGG重復(fù)41-54次）在POF患者中的發(fā)生率略高于正常對(duì)照，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.9％vs.1.7％，P=0.343)。POF患者的FM

14、R1兩等位基因均比正常對(duì)照多一個(gè)CGG重復(fù)(allele-1;29.7 vs.28.8，P＜0.001; allele-2:32.6vs.31.5，P＜0.001)。攜帶FMR1純合突變型的POF患者比正常基因型攜帶者的閉經(jīng)年齡提前約4-6年（hom-high/high vs.norm:20.4±4.8 vs.24.7±6.4,P＜0.01; hom-low/high vs.norm:18.7±1.7 vs.24.7±6.4,P＜0.0