P物質(zhì)在脊髓損傷后骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用機(jī)制.pdf

1、骨質(zhì)疏松是脊髓損傷的常見并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)理尚不清楚。神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)骨的調(diào)節(jié)作用是近年來研究的重要進(jìn)展之一，研究表明神經(jīng)因素在骨重建過程中可能起到十分關(guān)鍵的作用。 本課題首次探討SP在脊髓損傷后骨質(zhì)疏松中的作用機(jī)制，并比較與廢用性骨質(zhì)疏松的差別。從組織、細(xì)胞和分子水平上探討SP免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維及其受體的分布、SP對(duì)脊髓損傷后MSCs源性成骨細(xì)胞的影響，對(duì)骨重建相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響等。 第一部分：脊髓損傷和后肢制動(dòng)對(duì)生長(zhǎng)

2、期大鼠脊髓損傷平面上下骨組織的骨量、骨結(jié)構(gòu)、骨生物力學(xué)和骨代謝影響的比較研究 脊髓損傷患者下肢和骨盆的骨量丟失速度較快，很容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。但是目前關(guān)于脊髓損傷后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制和治療的研究仍較少，特別是對(duì)脊髓損傷后骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)不深。脊髓損傷與臥床和失重相比能引起更嚴(yán)重的骨量丟失，活動(dòng)的喪失在骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中可能起到重要作用。除此以外，神經(jīng)損傷和代謝的改變也可能參與脊髓損傷后骨量的丟失。 目的：

3、 本研究的目的是觀察脊髓損傷和后肢制動(dòng)對(duì)雄性大鼠脊髓損傷平面上下骨組織的影響。比較骨量、骨結(jié)構(gòu)、骨生物力學(xué)和骨代謝等指標(biāo)的差異，從而推測(cè)脊髓損傷后導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的可能原因。 材料與方法： 40只6周齡雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為四組：基線對(duì)照組，年齡匹配對(duì)照組，后肢制動(dòng)組，脊髓損傷組。在術(shù)后第4周分別取尿液、血清和骨組織標(biāo)本。左側(cè)腓腸肌立即稱重；左側(cè)肱骨、脛骨測(cè)量長(zhǎng)度、濕重、體積。接下來用雙能X線法測(cè)量

4、左肱骨、脛骨骨礦含量和骨密度；然后進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試；之后測(cè)量干重和灰重。右側(cè)肱骨、脛骨首先進(jìn)行Micro-CT掃描；然后進(jìn)行動(dòng)態(tài)的骨組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)。用EIA方法分別測(cè)量血清和尿液中骨鈣素和脫氧吡啶諾林的含量。 結(jié)果： 脊髓損傷和后肢制動(dòng)均能引起生長(zhǎng)期大鼠后肢成熟相關(guān)性骨量增加的減少，并且兩者導(dǎo)致的骨丟失有明顯的差異。脊髓損傷組脛骨的干重和灰重較后肢制動(dòng)組有明顯的下降，分別減少了7.5％和8.2％。 結(jié)論：

5、 雖然脊髓損傷和后肢制動(dòng)均能引起大鼠脛骨的骨量丟失、骨結(jié)構(gòu)退變和骨強(qiáng)度的降低，但是兩種損傷對(duì)骨代謝的影響是不同的。脊髓損傷導(dǎo)致更為嚴(yán)重的骨量丟失、骨小梁微結(jié)構(gòu)和骨皮質(zhì)的幾何結(jié)構(gòu)的破壞、骨力學(xué)性能的下降。同時(shí)，脊髓損傷引起骨代謝處于高轉(zhuǎn)換狀態(tài)。通過以上結(jié)論我們推測(cè)神經(jīng)損傷因素是導(dǎo)致脊髓損傷后骨質(zhì)疏松的一個(gè)主要原因。 第二部分：脊髓損傷和后肢制動(dòng)對(duì)脊髓損傷平面上下骨組織中P物質(zhì)免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維分布影響的比較研究 雖然脊髓損傷

6、和后肢制動(dòng)都會(huì)導(dǎo)致骨量丟失，但是這兩種損傷對(duì)骨重建的作用有一定的差異。本論文的第一部分已經(jīng)證明了兩組動(dòng)物模型在脊髓損傷平面以下脛骨的骨量、骨結(jié)構(gòu)、骨生物力學(xué)、骨代謝的差異，從而推測(cè)神經(jīng)因素在脊髓損傷后骨質(zhì)疏松發(fā)病中起到了重要作用。 目的： 本研究的目的是觀察脊髓損傷和后肢制動(dòng)在不同時(shí)間段內(nèi)對(duì)脊髓損傷平面上下骨組織的影響。比較骨密度、骨組織形態(tài)學(xué)、SP免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維的分布、骨組織微環(huán)境中SP含量的變化。從而推測(cè)SP在脊髓

7、損傷后骨質(zhì)疏松發(fā)病中起重要作用。 材料與方法： 108只6周齡Sprague-Dawley雄性大鼠隨機(jī)分為9組(n=12/組)，以1、3、6周作為本實(shí)驗(yàn)研究的時(shí)間點(diǎn)。分組情況如下：脊髓損傷1周組、脊髓損傷3周組、脊髓損傷6周組、后肢制動(dòng)1周組、后肢制動(dòng)3周組、后肢制動(dòng)6周組、對(duì)照1周組、對(duì)照3周組、對(duì)照6周組。 結(jié)果： 免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脊髓損傷1周、3周和6周右脛骨近端SP免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維的染色均高于相應(yīng)

8、的后肢制動(dòng)組和對(duì)照組。而右肱骨近端SP的染色在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的各組間無差異。 結(jié)論： 脊髓損傷與后肢制動(dòng)相比能引起更嚴(yán)重的骨量丟失、骨結(jié)構(gòu)退變。這種改變伴隨著損傷早期SP免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維分布的增加和SP在骨組織微環(huán)境中含量的增加。 第三部分：P物質(zhì)對(duì)脊髓損傷后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 許多研究表明SP增強(qiáng)了破骨細(xì)胞的骨吸收作用，但對(duì)成骨細(xì)胞的研究較少。并且，SP對(duì)脊髓損傷后大鼠骨髓MS

9、Cs源性成骨細(xì)胞的影響至今未見報(bào)導(dǎo)。 目的： 本研究主要目的是研究脊髓損傷后大鼠骨髓MSCs源性成骨細(xì)胞內(nèi)NK1受體的分布。觀察不同濃度、不同時(shí)間SP對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化、礦化的影響。并用SP非特異性的阻滯劑和NK1受體特異性的阻滯劑進(jìn)行干預(yù)，從而推測(cè)其作用細(xì)胞的靶受體。本研究探討SP對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，揭示其在脊髓損傷后骨質(zhì)疏松發(fā)病中的作用機(jī)制。 材料與方法： 10只雄性6周齡SD大鼠制作SC

10、I模型。取SCI三周大鼠的雙側(cè)脛骨、股骨，用DMEM完全培養(yǎng)液沖洗髓腔后收集細(xì)胞懸液。首先進(jìn)行骨髓MSCs源性成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)，用第二代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)MSCs源性成骨細(xì)胞內(nèi)是否有NK1受體的表達(dá)。 結(jié)果： 脊髓損傷后大鼠骨髓MSCs源性成骨細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)存在NK1受體的分布，胞漿內(nèi)含量較多。與對(duì)照組比較不同濃度的SP對(duì)細(xì)胞的增殖有不同程度的促進(jìn)作用，10-8M濃度的促進(jìn)作用最強(qiáng)(+124.5％，

11、P＜0.01)，且增殖具有時(shí)間依賴性，隨時(shí)間延長(zhǎng)增殖越旺盛(96h：+121.8％，P＜0.01)。細(xì)胞的增殖可以被Spantide和L703606所抑制，與SP組比較兩者分別抑制了48.3％和45.4％。 結(jié)論： 脊髓損傷后導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松，除了廢用這種機(jī)械性因素以外，神經(jīng)損傷所誘發(fā)的骨組織微環(huán)境中SP的增多有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)NK1受體存在于骨髓MSCs源性成骨細(xì)胞中，NK1受體是SP作用的靶受體，SP通過NK1受體

12、對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。本研究還發(fā)現(xiàn)盡管SP促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖，但SP抑制了成骨細(xì)胞的分化和礦化，使成熟的成骨細(xì)胞減少，從而引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生。 第四部分：P物質(zhì)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性成骨細(xì)胞和骨組織微環(huán)境中RANKL/OPG表達(dá)的影響 近年來，對(duì)骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)理的研究逐漸集中在破骨細(xì)胞分化的信號(hào)傳導(dǎo)上。其中核因子受體激活物(RANK)及其配體(RANKL)和骨保護(hù)蛋白(OPG)組成的細(xì)胞因子系統(tǒng)是最重要的途徑

13、。成骨細(xì)胞可以分泌RAHKL，RANK存在于單核-巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞表面。RANKL與單核-巨噬細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，骨吸收增強(qiáng)。OPG是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞/成骨細(xì)胞分泌的RANKL的“假目標(biāo)”受體，可以與RANKL競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，阻斷RANKL與RANK結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和功能。在骨重建過程中，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞在局部細(xì)胞因子的作用下，互相聯(lián)系，互相制約。 目的： 本研究目的是探討S

14、P對(duì)脊髓損傷后大鼠骨髓MSCs源性成骨細(xì)胞及骨組織微環(huán)境中RANKL/OPG表達(dá)的影響，從而揭示SP在骨代謝中的作用。 材料與方法： 20只雄性6周SD大鼠，分為SCⅠ組和SHAM。飼養(yǎng)3周后采用腹主動(dòng)脈放血法處死大鼠。收集右側(cè)脛骨，剔除周圍軟組織后測(cè)定其骨密度。左側(cè)的脛骨切取后立刻液氮冷凍保存，一部分用于骨組織提取RNA，半定量RT-PCR分析RANKL、OPG、Collal、OCN基因的表達(dá)變化；另一部分用于EIA方

15、法測(cè)量骨組織中RANKL和OPG的含量。取SCⅠ組雙側(cè)股骨，用DMEM完全培養(yǎng)液(GIBCO)沖洗髓腔后收集細(xì)胞懸液。骨髓MSCs源性成骨細(xì)胞培養(yǎng)至第二代，用10-8MSP進(jìn)行作用，對(duì)照組不加處理因素。用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法進(jìn)行RANKL和OPG的染色，免疫組化染色定量分析表達(dá)量的變化；用半定量RT-PCR分析RAHKL、OPG、Collal、OCN基因的表達(dá)變化；用EIA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中RANKL和OPG蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)

16、果： 3周時(shí)SCⅠ組脛骨的骨密度明顯低于SHAM組，骨密度的下降既發(fā)生在脛骨近端干骺端(-26.3％，P＜0.05)，又發(fā)生在脛骨干(-21.2％，P＜0.05)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)的方法進(jìn)行定量分析顯示，SP處理后比不加處理因素的MSCs源性成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL顯著增加(P＜0.05)。用RT-PCR的方法檢測(cè)，SCI后3周大鼠脛骨近端骨組織微環(huán)境中RANKL的表達(dá)顯著上調(diào)(+122.2％，P＜0.01)，OPG的表達(dá)顯著下調(diào)

17、(-22.1％，P＜0.05)，OCN的表達(dá)顯著下調(diào)(-25.3％，P＜0.05)。SP作用72h后MSCs源性成骨細(xì)胞RANKL的表達(dá)顯著上調(diào)(+160.2％，P＜0.01)，OPG的表達(dá)顯著下調(diào)(-45.5％，P＜0.01)，OCN的表達(dá)顯著下降(-42.9％，P＜0.01)。RANKL和OPG的表達(dá)也得到了EIA的證實(shí)。 結(jié)論： SP在成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞偶聯(lián)的關(guān)系中發(fā)揮重要作用。它既可以對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生直接作用(抑制