線粒體融合蛋白2在卵巢早衰動(dòng)物模型中的表達(dá)及其與卵巢早衰發(fā)病相關(guān)性的探討.pdf

1、本文分三個(gè)部分進(jìn)行探討。
　　第一部分：小鼠卵巢早衰模型的建立
　　目的：建立小鼠卵巢早衰（Premature ovarian failure, POF）動(dòng)物模型，為探討線粒體融合蛋白2（mitofusion2,Mfn2）與卵巢早衰相關(guān)性提供基礎(chǔ)。
　　方法：40只清潔級(jí)雌性昆明小鼠,分為處理組(腹腔注射順鉑1.5mg/kg體重，連續(xù)10天)、對(duì)照組（腹腔注射無菌生理鹽水，連續(xù)10天），每組20只。一月后剖取小鼠卵巢和

2、心臟取血，觀察小鼠卵巢重量及形態(tài)學(xué)、各級(jí)卵泡數(shù)的變化及性激素(雌二醇Estradiol，E2和卵泡刺激素Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平。
　　結(jié)果：順鉑可引起小鼠體重明顯下降，動(dòng)情周期紊亂，卵巢重量明顯減輕，卵巢間質(zhì)增生，竇前及竇狀卵泡敷減少明顯，與對(duì)照組相比具有明顯差異。血清中雌激素水平較對(duì)照組降低，卵泡刺激素水平與對(duì)照組相比明顯增高。
　　結(jié)論：采用腹腔注射順鉑連續(xù)注射10d的方案

3、建模，小鼠卵巢功能明顯衰退，卵巢組織學(xué)及內(nèi)分泌改變與臨床卵巢早衰患者相似，表明建模成功。
　　第二部分：Mfn2在卵巢早衰模型中的表達(dá)研究
　　目的：研究Mfn2在卵巢早衰模型中的表達(dá)情況，初步確定Mfn2與卵巢早衰的相關(guān)性。
　　方法：免疫組化觀察Mfn2在卵巢組織中的表達(dá)定位和半定量；采用蛋白印記（Western Blot）檢測(cè)對(duì)照組與處理組（即POF組）卵巢組織中Mfn2的蛋白表達(dá)情況；RT-PCR觀察Mfn2

4、mRNA在對(duì)照組與處理組中的表達(dá)。
　　結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示Mfn2定位于細(xì)胞胞漿，Mfn2的表達(dá)在處理組比對(duì)照組明顯降低（P<0.01）；Mfn2蛋白在處理組卵巢組織中的相對(duì)表達(dá)低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示處理組Mfn2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。
　　結(jié)論：與對(duì)照組相比，運(yùn)用上述三種檢測(cè)方法均顯示處理組卵巢組織中Mfn2的表達(dá)量明顯降低，提示卵巢早衰與Mfn2的表達(dá)具

5、有一定相關(guān)性。
　　第三部分：Mfn2與卵巢早衰發(fā)病機(jī)制相關(guān)性的探討
　　目的：通過檢測(cè)對(duì)照組及處理組卵巢組織中三磷酸腺苷(adenosine5’-triphosphate,ATP)含量和線粒體膜電勢(shì)，以及觀察卵巢組織中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；檢測(cè)兩組卵巢內(nèi)細(xì)胞的凋亡情況和凋亡相關(guān)蛋白Bcell lymphoma-2(Bcl-2)和Bcl-2 Associated X Protein(Bax)的表達(dá)，探討Mfn2在卵巢早衰組織中對(duì)線粒

6、體代謝及形態(tài)以及細(xì)胞凋亡的影響，從而揭示Mfn2在卵巢早衰中的可能作用機(jī)制。方法利用磷鉬酸比色法檢測(cè)2組卵巢組織中ATP含量。JC-1法檢測(cè)兩組卵巢組織中線粒體膜電勢(shì)的變化。透射電鏡（Transmission Electron Microscope,TEM）檢測(cè)3例對(duì)照組及6例處理組卵巢組織中細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。Tunel法檢測(cè)對(duì)照組與處理組卵巢組織中細(xì)胞凋亡情況。Western Blot法檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況。
　　

7、結(jié)果：處理組卵巢組織中ATP含量明顯低于對(duì)照組（P<0.05），且線粒體膜電勢(shì)結(jié)果顯示處理組明顯低于對(duì)照組。對(duì)照組卵巢組織中細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)規(guī)則，輪廓光滑完整，線粒體嵴排列基本規(guī)則；處理組卵巢組織中細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)與對(duì)照組相差不大，但細(xì)胞內(nèi)有大量脂肪堆積，細(xì)胞間距增大，膠原纖維的出現(xiàn)意味著卵巢的纖維化，與對(duì)照組卵巢組織相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張不明顯。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示卵巢組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)處理組明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。而處理組卵巢