Purα對(duì)PARP1基因表達(dá)調(diào)控作用及在DNA損傷修復(fù)中作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：Purα是一種多功能蛋白質(zhì)，在體內(nèi)的多個(gè)環(huán)節(jié)上都發(fā)揮著重要的作用，特別在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著更為重要的作用。Purα蛋白質(zhì)在對(duì)DNA損傷與修復(fù)中的作用是非常明顯的。有研究也表明在由復(fù)制叉終止引起的DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)修復(fù)中，Purα蛋白對(duì)修復(fù)的DNA起著監(jiān)督的作用，這有助于維持基因組的穩(wěn)定性，在神經(jīng)退行性病變的發(fā)生中有著重要的意義。Purα的表達(dá)有特異性，與神經(jīng)元的發(fā)育

2、和突觸形成有密切的關(guān)系。PARP1是存在于真核細(xì)胞中催化聚ADP核糖化的核酶。它能識(shí)別極低水平的DNA損傷，激活相應(yīng)的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，修復(fù)受損的DNA；而在DNA損傷嚴(yán)重時(shí)，它能啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，從而維持了細(xì)胞遺傳物質(zhì)的完整性。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，Purα蛋白與PARP1蛋白有相互結(jié)合作用。然而，Purα蛋白是否調(diào)控PARP1基因的表達(dá)，如何進(jìn)行調(diào)控，正調(diào)控還是負(fù)調(diào)控，Purα蛋白的活性功能域究竟位于什么地方，目前仍然不是十

3、分清楚。我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^(guò)研究過(guò)表達(dá)Purα蛋白對(duì)PARP1基因表達(dá)的影響來(lái)確定Purα蛋白對(duì)PARP1基因表達(dá)的調(diào)控作用。同時(shí)，通過(guò)研究Purα缺失突變體對(duì)PARP1基因的作用效果來(lái)確定Purα蛋白的活性結(jié)構(gòu)域。此外，我們也通過(guò)研究Purα缺失突變體對(duì)APP基因的作用效果進(jìn)一步來(lái)確定Purα蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用中的活性結(jié)構(gòu)域。
　　方法：（1）根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增Purα基因的不同的缺失片段，構(gòu)建與GFP融合表達(dá)

4、的Purα缺失突變體（pEGFP-P1、pEGFP-P2、pEGFP-P3和pEGFP-P4）質(zhì)粒。（2）通過(guò)Pull down Assay和Co-IP，進(jìn)一步檢測(cè)Purα和PARP1的Physical interaction,即兩種蛋白之間是否存在實(shí)質(zhì)性的結(jié)合。（3）在HT22細(xì)胞中，通過(guò)Luciferase Assay，Real time PCR和Western blotting assay分別在啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平研究Purα蛋

5、白及其結(jié)構(gòu)突變體對(duì)PARP1基因的調(diào)控作用。（4）用2mM的羥基脲(hydroxyurea,HU)建立HT22細(xì)胞DNA損傷模型，通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀察兩種蛋白在DNA損傷的細(xì)胞內(nèi)的分布。同時(shí)，通過(guò)Western blotting assay研究過(guò)表達(dá)的Purα對(duì)PARP1蛋白的影響。（5）在HT22細(xì)胞中，通過(guò)研究過(guò)表達(dá)的Purα蛋白對(duì)mTOR通路中的信號(hào)分子的影響來(lái)探討Purα對(duì)PARP1蛋白的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：（1）經(jīng)雙酶

6、切鑒定和質(zhì)粒序列分析結(jié)果證明pEGFP-Purα缺失突變體質(zhì)粒構(gòu)建成功。（2）Pull down assay和Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Purα蛋白和PARP1蛋白存在相互結(jié)合作用。（3）Luciferase Assay、Real time PCR和Western blotting assay結(jié)果證實(shí)全長(zhǎng)Purα對(duì)PARP1基因有明顯的正向調(diào)控作用，四個(gè)突變體中P3對(duì)PARP1和APP的調(diào)控作用最為顯著。（4）DNA損傷模型下，Purα蛋白

7、和PARP1蛋白存在共區(qū)域化的現(xiàn)象。同時(shí)，Western blotting assay表明Purα蛋白可以促進(jìn)PARP1發(fā)揮其生物學(xué)功能，兩種蛋白對(duì)DNA損傷的修復(fù)有協(xié)同作用。（5）Western blotting assay發(fā)現(xiàn)Purα蛋白是通過(guò)mTOR通路來(lái)調(diào)控PARP1基因的表達(dá)。
　　結(jié)論：(1)Purα蛋白和PARP1蛋白之間有直接的結(jié)合作用（Physical interaction）。（2）Purα蛋白可以正向調(diào)控PA