Polη在肝細(xì)胞對(duì)氫醌所致DNA損傷反應(yīng)中的作用機(jī)制研究.pdf

1、1研究背景：
　　細(xì)胞常常受到外界環(huán)境及內(nèi)源性代謝因素如輻射、化學(xué)物和氧化應(yīng)激的攻擊。而這些暴露則可能導(dǎo)致突變和DNA鏈的斷裂，進(jìn)而引發(fā)基因組不穩(wěn)定性。為了克服環(huán)境有害因子的攻擊并維持基因組穩(wěn)定性，真核細(xì)胞通過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化，已形成了一種稱為DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)來(lái)感應(yīng)DNA損傷、發(fā)送損傷信號(hào)并對(duì)之進(jìn)行修復(fù)。DDR是由多種檢查點(diǎn)蛋白和修復(fù)蛋白構(gòu)成的，而這些相關(guān)蛋白能夠協(xié)調(diào)復(fù)雜的DNA損

2、傷信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而使得細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯以使其有充分的時(shí)間來(lái)進(jìn)行DNA修復(fù)或DNA損傷耐受，或者觸發(fā)細(xì)胞凋亡。
　　最近的研究證據(jù)表明，人類DNA聚合酶η(Polη)參與了DDR。Polη是癌癥易感性疾病—著色性干皮病變種(xerodermapigmentosum variant，XPV)基因的編碼產(chǎn)物。Polη屬于Y族DNA聚合酶，它能夠催化DNA合成反應(yīng)以跨越因紫外線輻射所產(chǎn)生的能夠阻礙復(fù)制性聚合酶進(jìn)程的順-反式環(huán)丁烷嘧啶

3、二聚體(cyclobutanepyrimidine dimmers，CPDs)。研究表明，除了CPDs以外，Polη還能夠跨越其它類型的DNA損傷，比如順鉑加合物、丁二烯所誘發(fā)生成的2'-脫氧尿苷以及一氧化氮所產(chǎn)生的加合物2'-脫氧肌苷等。此外，Polη參與了免疫球蛋白基因的體細(xì)胞超突變、同源重組和DNA脆性位點(diǎn)的復(fù)制。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，Polη在人類細(xì)胞中參與了抑制8-羥基鳥(niǎo)嘌呤所誘發(fā)的突變，并可阻止基因組不穩(wěn)定性以及與DNA雙鏈斷裂

4、密切相關(guān)的γ-H2AX的形成。這些研究表明，除了參與跨損傷合成所介導(dǎo)的DNA損傷耐受以外，Polη在對(duì)各種內(nèi)源性和外源性遺傳毒性因子所致DNA損傷的反應(yīng)當(dāng)中還具有著其它重要的生物學(xué)功能。
　　氫醌(hydroquinone，HQ)在自然界中天然地存在于細(xì)菌、植物和某些動(dòng)物體內(nèi)，也可因商業(yè)用途而被生產(chǎn)出來(lái)。目前，HQ主要用于化妝品中的皮膚增白劑、黑白攝影術(shù)的顯影劑、橡膠抗氧化劑、不飽和單體如醋酸乙烯酯和丙烯酸單體的阻聚劑等。HQ也存

5、在煙草、咖啡、麥類制品和紅酒當(dāng)中。人類可以通過(guò)環(huán)境、職業(yè)、飲食和吸煙等多種途徑接觸到HQ;也可通過(guò)對(duì)苯的暴露而接觸到HQ，因?yàn)楸娇稍隗w內(nèi)代謝為HQ。HQ可經(jīng)皮膚、消化道和呼吸道等途徑吸收，主要在肝臟內(nèi)代謝。
　　由于HQ應(yīng)用的廣泛性，國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者已對(duì)之進(jìn)行了大量的毒性研究。嚙齒類動(dòng)物的慢性毒性研究表明，HQ可以引起肝腎腫瘤，并可引起白血病。許多研究表明HQ能夠觸發(fā)機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激過(guò)程，從而產(chǎn)生活性氧類，并可通過(guò)不同的機(jī)制引起明顯

6、的染色體異常和DNA損傷。因此，DNA損傷常被用作HQ的毒性終點(diǎn)。此外，HQ在人體細(xì)胞內(nèi)能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡，并干擾細(xì)胞周期的進(jìn)展。雖然目前人們對(duì)于Polη在跨損傷合成中的作用已有了很好的了解，但是對(duì)于其在DDR過(guò)程當(dāng)中的作用仍不太明確。
　　為了更好地理解Polη在人類肝細(xì)胞內(nèi)的功能性作用及其重要性，我們采用了RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)來(lái)選擇性敲低Polη在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，并通過(guò)測(cè)定其對(duì)細(xì)胞增生

7、、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)展和DNA鏈斷裂以及DNA損傷反應(yīng)通路活化程度的影響，以確定肝細(xì)胞內(nèi)Polη的缺失是如何影響HQ的細(xì)胞毒性及遺傳毒性的。本研究的目的就是初步闡明Polη在肝細(xì)胞對(duì)HQ所致DNA損傷反應(yīng)中的作用及其機(jī)制，從而為建立機(jī)體對(duì)HQ所致?lián)p傷的防御體系提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　2研究方法：
　　2.1 Polη缺陷肝細(xì)胞株的建立及鑒定
　　根據(jù)POLH的目標(biāo)序列，使用siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)編碼shRNA

8、s的寡核菅酸序列和1對(duì)編碼非靶向shRNA的寡核苷酸序列，并送于上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。接著將所合成的shRNA寡核苷酸序列退火，并將之克隆到pLKO.1載體的AgeI和EcoRI位點(diǎn)上以產(chǎn)生RNAi載體;接著將這些重組載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)JM109細(xì)菌當(dāng)中;收集各細(xì)菌克隆以備提取質(zhì)粒之用。然后將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。將經(jīng)測(cè)序鑒定成功的陽(yáng)性質(zhì)粒分別命名為pLKO.1-POLH1、pLKO.1-POLH2、 pLKO.1-POLH3

9、和pLKO.1-C,接著采用脂質(zhì)體2000試劑盒按照使用說(shuō)明書(shū)將各陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，并進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝及濃縮。慢病毒顆粒感染細(xì)胞，并采用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)POLH shRNA和陰性對(duì)照shRNA的細(xì)胞株，并將各細(xì)胞株分別命名為L(zhǎng)02-POLH-sh1、L02-POLH-sh2、L02-POLH-sh3和L02-POLH-nsc（非特異性靶向siRNA對(duì)照）細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot技術(shù)分別對(duì)P

10、OLH的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行鑒定。此外，對(duì)上述各細(xì)胞株的生物學(xué)特征如細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增生和細(xì)胞周期等進(jìn)行比較分析。
　　2.2 Polη表達(dá)抑制對(duì)HQ作用條件下肝細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特征和DNA損傷的影響
　　(1)將指數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞用0、10、20、40、80、160和320μM的HQ作用24 h，采用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，并采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。
　　(2)將L02-POLH-nsc和L02

11、-POLH-sh肝細(xì)胞分別用0、10、20和40μM的HQ作用24 h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況，并采用DAPI熒光染色法觀察各組凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)。
　　(3)將L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh肝細(xì)胞分別用0、10、20和40μM的HQ作用24 h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布狀況。每個(gè)樣品至少收集10000個(gè)細(xì)胞，采用FACSAriaTM型流式細(xì)胞儀上所附帶的CellQuest軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分

12、析，并采用ModFit LT軟件對(duì)細(xì)胞周期各時(shí)相的構(gòu)成比進(jìn)行量化。
　　(4)將L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh肝細(xì)胞分別用0、10、20和40μM的HQ作用24 h，采用彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷狀況，采用CASP分析軟件測(cè)算每個(gè)彗星的相關(guān)參數(shù);采用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察γ-H2AX焦點(diǎn)的生成情況。
　　2.3 Polη表達(dá)抑制對(duì)HQ作用條件下肝細(xì)胞內(nèi)DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白的表達(dá)、磷酸化及其亞細(xì)胞定位的影響

13、
　　將L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh肝細(xì)胞分別用0、10、20和40μM的HQ作用24 h，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)各DNA損傷檢查點(diǎn)基因(ATM、ATR、Chk1、 Chk2、p53、H2AX和RPA2)的mRNA表達(dá)水平，并采用RQ Manager1.2軟件對(duì)各目的基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。采用Western blot檢測(cè)DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白（ATM、ATR、Chk1、Chk2、p53、H2A

14、X和RPA2）及其磷酸化蛋白(p-Chk1、p-Chk2、 p-p53、γ-H2AX和p-RPA2)進(jìn)行檢測(cè)，并采用ImageJ軟件對(duì)各目的蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察各DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白的亞細(xì)胞定位特征。
　　2.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS14.0 for windows軟件對(duì)之進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間的比較采用t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)

15、組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用Tukey法進(jìn)行任兩組之間的比較;規(guī)定P＜0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3研究結(jié)果：
　　3.1 Polη缺陷肝細(xì)胞株的建立及鑒定
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞即正常L-02肝細(xì)胞相比較，L02-POLH-sh1、L02-POLH-sh2和L02-POLH-sh3細(xì)胞內(nèi)POLH基因mRNA表達(dá)的抑制率分別為61％、60％和82％，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

16、＜0.05);而L-02肝細(xì)胞、L02-POLH-nvc和L02-POLH-nsc細(xì)胞POLH基因mRNA表達(dá)水平之間的差別卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L02-POLH-sh1、L02-POLH-sh2和L02-POLH-sh3細(xì)胞內(nèi)Polη在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上的抑制率分別為57.46％、71.49％和85.84％，與L-02細(xì)胞相比較，差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而L-02肝細(xì)胞、L02

17、-POLH-nvc和L02-POLH-nsc細(xì)胞內(nèi)Polη的蛋白質(zhì)表達(dá)水平之間的差別則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。此外，L02-POLH-sh1、L02-POLH-sh2、L02-POLH-sh3，L02-POLH-nsc、L02-POLH-nvc和L-02細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)特征方面沒(méi)有明顯差別。由于Polη在L02-POLH-sh3細(xì)胞內(nèi)的抑制效率最好，因此將L02-POLH-sh3命名為L(zhǎng)02-POLH-sh，并作為后續(xù)研究的工具細(xì)

18、胞。
　　3.2 Polη表達(dá)抑制對(duì)HQ作用條件下肝細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特征和DNA損傷的影響
　　(1) MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未處理對(duì)照組相比較，其中10、20、40和80μM的HQ對(duì)L-02、L02-POLH-nsc肝細(xì)胞的相對(duì)存活率沒(méi)有明顯影響（P＞0.05），而160和320μM的HQ則可明顯降低肝細(xì)胞的存活水平，與未處理對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而對(duì)于L02-POLH-sh細(xì)胞而言，10和20μM組

19、與未處理對(duì)照組相比較，細(xì)胞相對(duì)存活率無(wú)明顯差異（P＞0.05）;當(dāng)HQ作用劑量高于40μM就可導(dǎo)致細(xì)胞活力的明顯降低（P＜0.01）。L02-POLH-sh細(xì)胞對(duì)HQ的敏感性明顯高于L-02和L02-POLH-nsc細(xì)胞。此外，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。
　　(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在0～40μM濃度范圍內(nèi)，HQ可誘導(dǎo)L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細(xì)胞發(fā)生凋亡，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。對(duì)L0

20、2-POLH-nsc細(xì)胞而言，0、10、20和40μM劑量組的細(xì)胞調(diào)亡率依次為:2.73％、3.77％、5.27％、6.63％;而對(duì)L02-POLH-sh細(xì)胞而言，0、10、20和40μM劑量組的細(xì)胞調(diào)亡率則依次為:3.24％、6.78％、10.70％、14.03％;并且各處理組與未處理對(duì)照組相比較，均明顯地高于未處理對(duì)照組(P＜0.05)。在相同的作用劑量條件下，HQ對(duì)L02-POLH-sh細(xì)胞所誘發(fā)的凋亡率明顯地高于L02-POLH

21、-nsc細(xì)胞(P＜0.01);而在0μM的HQ作用條件下，L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細(xì)胞之間的凋亡率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。此外，DAPI熒光染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果基本相符。
　　(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，HQ作用后，L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細(xì)胞的細(xì)胞周期各時(shí)相分布特征發(fā)生了明顯地改變，表現(xiàn)為G1期細(xì)胞比例的減少、S期和G2期細(xì)胞比例的相應(yīng)增加。對(duì)于L0

22、2-POLH-nsc細(xì)胞而言，10μM.和20μM組的S期細(xì)胞比例與未處理對(duì)照組相比較其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而40μM組的S期細(xì)胞比例則明顯地高于未處理組(P＜0.05)，其數(shù)值分別由未處理組的25.93％增加至27.54％、27.93％和35.02％。而對(duì)于L02-POLH-sh細(xì)胞來(lái)說(shuō)，10、20和40μM的HQ與未處理對(duì)照組相比較均可引起S期細(xì)胞的明顯增加(P＜0.05)，其具體數(shù)值分別由未處理組的27.80％增加至

23、36.42％（10 LLM組）、40.72％（20μM組）和44.42％（40μM組）。此外，在相同的HQ作用劑量(10、20或40μM)下，與L02-POLH-nsc細(xì)胞相比較，L02-POLH-sh細(xì)胞的S期細(xì)胞比例均有明顯地增加(P＜0.05)。
　　(4)彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HQ以劑量依賴性的方式誘導(dǎo)L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細(xì)胞DNA損傷水平增加。在相同的HQ作用劑量條件下，L02-POLH-sh細(xì)胞

24、DNA損傷的程度明顯地大于L02-POLH-nsc細(xì)胞，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。細(xì)胞免疫熒光聯(lián)合激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，HQ作用后，L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細(xì)胞內(nèi)的γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)均有隨著HQ作用劑量的增加而增加的趨勢(shì)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性;在相同的HQ作用劑量條件下，L02-POLH-sh細(xì)胞內(nèi)的γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)明顯地多于L02-POLH-nsc細(xì)胞(P＜0.05)。3.3 Polη

25、表達(dá)抑制對(duì)HQ作用條件下肝細(xì)胞內(nèi)DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白的表達(dá)、磷酸化及其亞細(xì)胞定位的影響
　　(1)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HQ能夠誘導(dǎo)ATM、ATR、CHK1、CHK2、P53和RPA2基因的mRNA表達(dá)水平在L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細(xì)胞內(nèi)以劑量依賴性方式增加;在相同的HQ作用條件下，L02-POLH-sh細(xì)胞內(nèi)CHK1、P53和RPA2基因的mRNA表達(dá)水平明顯地高于L02-POLH-nsc細(xì)胞。

26、r>　　(2) Western blot分析結(jié)果顯示，HQ能夠在L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)ATM、ATR、Chk2、p53、RPA2、p-chk1、p-chk2、p-p53、p-RPA2和γ-H2AX的蛋白表達(dá)水平增加。HQ能夠在L02-POLH-sh細(xì)胞誘導(dǎo)Chk1蛋白表達(dá)水平的升高，而在L02-POLH-nsc細(xì)胞內(nèi)卻無(wú)此現(xiàn)象。此外，在相同的HQ作用條件下，L02-POLH-sh細(xì)胞內(nèi)Chk1、 p5

27、3、RPA2、p-chk1、p-chk2、p-p53、p-RPA2和γ-H2AX的蛋白表達(dá)水平明顯地高于L02-POLH-nsc細(xì)胞。
　　(3)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HQ能夠在L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)ATM、ATR、Chk1、Chk2、p53、RPA2、p-chk1、p-chk2、p-p53、p-RPA2和γ-H2AX熒光強(qiáng)度的增加。在相同的HQ作用條件下，L02-POLH-sh細(xì)胞內(nèi)Chk

28、1、 p53、RPA2、p-chk1、p-chk2、p-p53、p-RPA2和γ-H2AX的熒光強(qiáng)度明顯地高于L02-POLH-nsc細(xì)胞。各目的蛋白的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，HQ能夠?qū)е翧TM和Chk2從細(xì)胞核移位到細(xì)胞漿;而Polη的缺陷則會(huì)導(dǎo)致Chk1和p53從細(xì)胞漿移位至細(xì)胞核內(nèi)。此外，RPA2在L02-POLH-nsc和L02-POLH-sh細(xì)胞內(nèi)能夠與γ-H2AX共定位在一起，并且該種共定位會(huì)隨著HQ作用劑量的增加而增強(qiáng)。此

29、外，Polη的抑制會(huì)使RPA2與γ-H2AX的共定位效應(yīng)得到明顯的增強(qiáng)。
　　4結(jié)論：
　　(1)本研究采用RNA干擾技術(shù)成功建立了Polη缺陷的肝細(xì)胞株，這為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了基礎(chǔ)。
　　(2) Polη表達(dá)的抑制導(dǎo)致了HQ作用條件下肝細(xì)胞增生的減少，并使肝細(xì)胞對(duì)HQ所致細(xì)胞毒性的敏感性增強(qiáng)。
　　(3) Polη的缺陷明顯增加了HQ所致肝細(xì)胞DNA雙鏈斷裂的形成或積累程度。
　　(4) Polη表達(dá)

30、的抑制在肝細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)了HQ所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，并增強(qiáng)了HQ在肝細(xì)胞內(nèi)所引起的細(xì)胞周期的S期阻滯現(xiàn)象。
　　(5)HQ作用條件下，Polη的缺陷明顯增加了Chk1、p53和RPA2在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平及其在細(xì)胞核內(nèi)的定位。
　　(6) HQ可在肝細(xì)胞內(nèi)引起DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白Chk1、Chk2、p53、H2AX和RPA2的強(qiáng)烈磷酸化;并且這些蛋白的磷酸化效應(yīng)在Polrη有缺陷的肝細(xì)胞內(nèi)得到了明顯的增強(qiáng)。
　　(7) P