硫辛酸對(duì)氫醌所致V79細(xì)胞線粒體膜電位損傷的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，室內(nèi)裝修與裝飾已很普遍，使室內(nèi)污染成為人們關(guān)注的問(wèn)題。兒童少年正處于快速生長(zhǎng)發(fā)育期，與成人比較，室內(nèi)污染對(duì)兒童少年健康的危害更加嚴(yán)重。兒童患呼吸系統(tǒng)疾病尤其是哮喘的發(fā)病率逐年升高，究其原因可能與環(huán)境污染程度加重，室內(nèi)外空氣中含有的粉塵，二氧化碳，甲醛，苯，氨以及香煙的煙霧等有關(guān)。然而，這些污染物造成的肺損傷機(jī)制尚不十分清楚。本研究以廣泛存在于油漆及裝飾材料中苯的主要代謝產(chǎn)物氫醌Hydroquinone，H

2、Q)為毒物，研究其對(duì)肺組織的毒性機(jī)制，并探討有效的預(yù)防和干預(yù)方法。 HQ是苯在體內(nèi)的重要代謝產(chǎn)物，在自然界中廣泛存在，同時(shí)也是香煙煙霧和焦油中的主要成分之一。HQ在體內(nèi)代謝過(guò)程中可產(chǎn)生大量自由基導(dǎo)致支氣管和肺的損傷，但目前確切機(jī)制尚不十分清楚。已知線粒體在外來(lái)化學(xué)物所致的細(xì)胞損傷，尤其是氧化損傷中為主要的靶細(xì)胞器，線粒體損傷是導(dǎo)致多種疾病發(fā)生的主要病理機(jī)制之一。硫辛酸(R-a-Lipoic Acid，LA)是目前備受關(guān)注的抗氧化

3、劑，已經(jīng)廣泛用于糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防和治療中。本文采用噻唑藍(lán)(MTT)和線粒體特異性探針(5，5’，6，6’-17etrachloro-1，1’，3，3'-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide，JC-1)的方法，檢測(cè)氫醌對(duì)體外培養(yǎng)的中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞(V79)的毒性作用，并重點(diǎn)研究HQ對(duì)線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，△Ψm)的影響，同時(shí)選擇硫辛酸(R-a-Li

4、poic Acid，LA)作為抗氧化劑，進(jìn)行干預(yù)性研究，為進(jìn)一步研究HQ的病理發(fā)生機(jī)制，采取有效的預(yù)防與治療措施提供理論依據(jù)。 研究目的： 1、探討不同劑量HQ對(duì)V79細(xì)胞的毒性作用。 2、探討能引起V79細(xì)胞毒性作用的HQ劑量對(duì)V79細(xì)胞線粒體膜電位的影響. 3、采用LA進(jìn)行干預(yù)性研究，確定LA的適宜干預(yù)劑量及可能保護(hù)機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)材料和方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞(V79

5、)，HQ，LA，DMEM高糖培養(yǎng)液，胎牛血清，胰蛋白酶-EDTA，JC-1，MTT。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、細(xì)胞的培養(yǎng)與分組 V79細(xì)胞用細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液含10％胎牛血清，100U／mL青霉素和100gμg/ml鏈霉素)置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，每2天換液1次。 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的V79細(xì)胞按105個(gè)／ml的細(xì)胞密度接種到96孔板、6孔板和培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后換成含1％胎牛血清的培養(yǎng)液，并分組

6、施加以下處理因素：①對(duì)照組：?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)液培養(yǎng)。②HQ組：HQ終濃度為10，20，30，40，50，100，1501maol／L.③LA組：LA終濃度為50，100μmol/L.④LA+HQ組1：LA終濃度為50，1001maol／L；HQ終濃度為50μmol／L。⑤LA+HQ組2：LA濃度同④組，HQ終濃度為1001amol／L。繼續(xù)培養(yǎng)24h。 2、細(xì)胞存活率的測(cè)定 MTT法 3、線粒體膜電位的測(cè)定 流式

7、細(xì)胞術(shù)和倒置熒光顯微鏡 4、統(tǒng)計(jì)分析 采用SPsS11.5統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析處理，數(shù)據(jù)用-x±s表示，檢驗(yàn)標(biāo)注a=0.05。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、不同濃度HQ對(duì)V79細(xì)胞存活率的影響 與對(duì)照組比較，當(dāng)HQ為40μmol/L時(shí)，V79細(xì)胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且HQ在40～150μmol/L范圍內(nèi)，隨著HQ濃度增高，V79細(xì)胞存活率下降，呈劑量．效應(yīng)關(guān)系。 二

8、、LA對(duì)HQ所致V79細(xì)胞存活率下降的干預(yù)作用 與對(duì)照組比較，LA為50和100μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活率沒(méi)有影響，但此濃度下的LA可以明顯拮抗50和100μmol/L HQ所引起的V79細(xì)胞存活率的下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 三、LA對(duì)HQ所致V79細(xì)胞線粒體膜電位影響的干預(yù)作用 對(duì)照組V79細(xì)胞線粒體膜電位為1.12，當(dāng)50、100μmol/L的HQ作用于V79細(xì)胞時(shí)線粒體膜電位明顯降低，分別