氧化油脂對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞損傷機(jī)制的研究.pdf

1、試驗(yàn)一草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)肝細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)
　　離體培養(yǎng)的肝細(xì)胞在短期內(nèi)形態(tài)和功能會(huì)發(fā)現(xiàn)顯著變化,為探討其在這變化期間的最佳功能狀態(tài),在不同條件下進(jìn)行原代培養(yǎng),以探討適合草魚(yú)肝細(xì)胞生長(zhǎng)的最佳條件及培養(yǎng)方法,用于飼料營(yíng)養(yǎng)與非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞代謝、損傷作用機(jī)制的研究。采用改進(jìn)的胰蛋白酶消化法和紅細(xì)胞裂解液分離、純化肝細(xì)胞,置于已配置好的M199培養(yǎng)基中進(jìn)行原代培養(yǎng)。通過(guò)顯微鏡計(jì)數(shù)法和臺(tái)盼藍(lán)排

2、斥法計(jì)算細(xì)胞產(chǎn)量和存活率;MTT比色法連續(xù)測(cè)試培養(yǎng)6d肝細(xì)胞的活力;熒光顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,并收集不同時(shí)期培養(yǎng)液上清,檢測(cè)肝細(xì)胞白蛋白分泌、尿素合成功能和LDH釋放量。結(jié)果顯示采用0.25％濃度的溫胰蛋白酶消化法,消化20min,分步收集肝細(xì)胞,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)和血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),活細(xì)胞數(shù)≥99%。在含10%胎牛血清、10μg/mL胰島素的M199培養(yǎng)基中,以接種濃度1.7×106 c ell/mL左右為宜,置于27℃、4.5%C

3、O2濃度的恒溫培養(yǎng)箱中可成功培養(yǎng)草魚(yú)原代肝細(xì)胞。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在培養(yǎng)第2d時(shí)A值最高,細(xì)胞處于最佳狀態(tài)。熒光纖維鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞成多邊形生長(zhǎng),細(xì)胞周圍有大量偽足伸出,使其貼壁更加牢固,細(xì)胞間隔清晰可見(jiàn),高倍鏡下可見(jiàn)圓形細(xì)胞核。細(xì)胞可生長(zhǎng)10d以上。肝功能檢測(cè)結(jié)果顯示24~72h階段細(xì)胞增殖能力強(qiáng),LDH含量顯著性降低(P<0.05),BUN含量明顯增加(P<0.05),白蛋白含量呈上升趨勢(shì)。此階段肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最好,適合用于肝細(xì)胞代謝

4、、損傷及基因表達(dá)的研究。
　　試驗(yàn)二氧化豆油水溶物對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞損傷作用的研究
　　本研究以草魚(yú)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞為試驗(yàn)材料,研究不同濃度和不同作用時(shí)間氧化豆油水溶物對(duì)草魚(yú)肝細(xì)胞的毒理影響。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)、總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量,采用油紅 O和堿性磷酸酶染色以及透射電鏡等方法檢測(cè)和觀察肝細(xì)胞的生長(zhǎng)變化。結(jié)果顯示高濃度(0.22656、0.15104g)組氧化豆油水溶物作用3h就可導(dǎo)

5、致草魚(yú)肝細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,LDH釋放量增加,T-AOC能力提高,MDA含量較高。草魚(yú)肝細(xì)胞的損傷程度與水溶液的作用濃度和時(shí)間存在顯著性關(guān)系,高濃度組與對(duì)照組相比損傷嚴(yán)重,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)肝細(xì)胞加劇凋亡。
　　試驗(yàn)三氧化豆油水溶物對(duì)草魚(yú)原代肝細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)活性的影響
　　以原代培養(yǎng)24h的草魚(yú)肝細(xì)胞為研究對(duì)象,添加0.22656g氧化豆油所含水溶物,分別作用1、1.5、2、2.5和3h,收集草魚(yú)肝細(xì)胞樣品,探討氧化豆油水溶

6、物對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用。采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)方法,檢測(cè)草魚(yú)肝細(xì)胞 IGF、PPAR-α、PPAR-γ、FAS、PGC1-α、SCD1、UCP2的mRNA表達(dá)量。各試驗(yàn)組的IGF-Ⅰ、UCP2、PGC1-α、PPAR-α基因表達(dá)量與對(duì)照組相比,均呈現(xiàn)顯著性下調(diào)(P<0.05); FAS、SCD1、PPAR-γ的基因表達(dá)量與對(duì)照組相比,均呈現(xiàn)顯著性上調(diào)(P<0.05);且各基因試驗(yàn)組中2.5、3h各基因表達(dá)量與1h相比