DNA損傷修復(fù)在輻射適應(yīng)性反應(yīng)中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、人類的生存環(huán)境中充滿了各種各樣的低劑量電離輻射,如室內(nèi)氡輻射、核電輻射、臨床輻射治療、宇宙輻射和其他職業(yè)性輻射等。人體不可避免的受到這些電離輻射的影響。對(duì)各種外界的有害刺激,人體內(nèi)部有一套完善的防御體系來抵制這些有害物質(zhì)對(duì)身體的損傷,其中輻射誘導(dǎo)的適應(yīng)性效應(yīng)(RAR)就是人體防御體系的生動(dòng)體現(xiàn)。RAR是一種塵物防御機(jī)制,是指低劑量輻射可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)隨后高劑量照射的抵抗能力,從而降低高劑量輻射引起的損傷。目前為止,RAR的分子機(jī)制還不清楚

2、。RAR在細(xì)胞效應(yīng)上表現(xiàn)為細(xì)胞存活升高、而染色體畸變和凋亡下降,所以RAR的產(chǎn)生可能是由于DNA的損傷修復(fù)能力增強(qiáng)所致,但DNA損傷修復(fù)在RAR的作用一直存在爭(zhēng)議。本研究采用具有不同DNA損傷修復(fù)能力的三株中國倉鼠卵母細(xì)胞來探討γ-射線誘導(dǎo)的RAR與DNA損傷修復(fù)之間的關(guān)系,并通過研究促凋亡分子P53和抑凋亡分子NF-κB在張氏肝細(xì)胞RAR中的作用,借此來了解RAR產(chǎn)生過程中的細(xì)胞信號(hào)通路。
　　 第一部分:γ-射線誘導(dǎo)的輻射適

3、應(yīng)性效應(yīng)與DNA損傷修復(fù)之間的關(guān)系
　　 目的:探討γ-射線誘導(dǎo)的適應(yīng)性效應(yīng)及其細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力對(duì)輻射適應(yīng)性效應(yīng)的影響。
　　 方法:采用野生型的中國倉鼠卵母細(xì)胞(CHO-9)及其DNA損傷修復(fù)缺陷型細(xì)胞:EM-C11(由于XRCC1基因突變導(dǎo)致DNA單鏈斷裂修復(fù)缺陷)和XR-C1(由于DNA-PKcs基因突變導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂修復(fù)缺陷),首先進(jìn)行低劑量(0.016Gy或0.08Gy)的初始照射,間隔一定的時(shí)間(4

4、h或7h),再進(jìn)行高劑量(1Gy)的攻擊照射,然后檢測(cè)細(xì)胞微核形成率和克隆形成率的變化。用跨物種半定量RT-PCR法檢測(cè)野生型CHO細(xì)胞不同處理XRCC1,DNA-PKcs mRNA的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:當(dāng)初始劑量為0.08Gy,間隔4h后再施以1Gy的攻擊照射時(shí),三株細(xì)胞只有野生型的CHO-9有輻射適應(yīng)性反應(yīng)產(chǎn)生;但當(dāng)間隔時(shí)間延長(zhǎng)到7h時(shí),CHO-9和EM-C11均產(chǎn)生了輻射適應(yīng)性反應(yīng)。當(dāng)把初始照射劑量降低為0.016Gy

5、,間隔4h再施以1Gy的攻擊照射時(shí),三株細(xì)胞均產(chǎn)生了輻射適應(yīng)性反應(yīng)。RT-PCR結(jié)果顯示CHO-9細(xì)胞經(jīng)0.016Gy預(yù)處理組和直接1Gy單獨(dú)照射組相比,XRCC1,DNA-PKcsmRNA的表達(dá)變化無明顯差異,而0.08Gy預(yù)處理組XRCC1,DNA-PKcs mRNA的表達(dá)比直接1Gy單獨(dú)照射組高。
　　 結(jié)論:輻射適應(yīng)性反應(yīng)不僅與初始照射劑量及間隔時(shí)間有關(guān),而且與DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)。
　　 第二部分:P53和N

6、F-κB在γ-射線誘導(dǎo)張氏肝細(xì)胞產(chǎn)生的輻射適應(yīng)性效應(yīng)中的作用
　　 目的:為了闡明促凋亡分子P53蛋白和抑凋亡分子Nuclear Factor-κB(NF-κB)蛋白兩分子在RAR中的作用。
　　 方法:采用張氏肝細(xì)胞株,首先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行0.016Gy,0.08Gy,0.16Gy(劑量率為0.016Gy/min)γ-射線預(yù)照射,間隔4h,再給予2Gy/3Gy(劑量率為0.8Gy/min)的攻擊照射,檢測(cè)細(xì)胞的微核率;在照射

7、前3h分別用P53和NF-κB的特異性抑制劑PFT-α(20uM)、BAY11-7082(3uM)處理細(xì)胞,來觀察P53和NF-κB被抑制后對(duì)輻射適應(yīng)性效應(yīng)的影響;采用Western-Blot檢測(cè)不同處理后細(xì)胞內(nèi)P53、磷酸化P53(ser15)和核內(nèi)NF-κB蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:只有接受0.08Gy預(yù)照射的細(xì)胞產(chǎn)生了RAR,而0.016Gy和0.16Gy預(yù)照射不能引起RAR。同時(shí),P53抑制劑PFT-α處理細(xì)胞后引起

8、細(xì)胞的輻射敏感性下降,在攻擊劑量為2Gy時(shí)接受0.08Gy預(yù)照射細(xì)胞產(chǎn)生了無顯著意義的RAR,然而攻擊劑量升高到3Gy時(shí)細(xì)胞又產(chǎn)生了明顯的RAR。而細(xì)胞受到NF-κB的抑制劑BAY11-7082處理后,無論攻擊照射是2Gy還是3Gy,RAR效應(yīng)均消失。Western-Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞受0.08Gy照射和大劑量攻擊照射后,核內(nèi)NF-κB上調(diào),并且適應(yīng)性處理組的細(xì)胞核內(nèi)NF-κB水平比單獨(dú)照射組高。但0.08Gy照射并不能引起細(xì)胞內(nèi)P