KLF4在電離輻射致星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：人類顱腦及頭面部腫瘤在進(jìn)行放射治療的同時(shí)難免會(huì)造成正常大腦組織及面部器官的輻射損傷。星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦組織的最主要組成部分，本實(shí)驗(yàn)的目的在于研究Krüppel-like factor4(KLF4)在電離輻射致星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA損傷及其修復(fù)中所起的作用及其相應(yīng)的機(jī)制，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的放射治療及輻射防護(hù)提供新的思路和方法。
　　 KLF4在人體內(nèi)是一個(gè)在多種組織中廣泛表達(dá)的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，作為KLF因子家族的一員，KLF

2、4在細(xì)胞分化和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中扮演非常重要的角色。根據(jù)靶基因的不同，KLF4既可以激活又可以抑制轉(zhuǎn)錄作用。目前已知的KLF4在細(xì)胞損傷中的作用為： DNA損傷激活抑癌基因p53，繼而激活KLF4，KLF4通過(guò)激活或抑制下游基因如p21的表達(dá)顯示出如調(diào)節(jié)G1/S期和G2/M期周期過(guò)渡等多重效應(yīng)。此外，在特定的細(xì)胞微環(huán)境情況下，KLF4既可以作為腫瘤抑制因子也可以作為癌基因。
　　 ShuheiMatsuoka等人的工作表明，很多蛋白

3、在DNA受到損傷后既參與周期阻滯又逆向參與DNA損傷及其重組修復(fù)，那么在中樞神經(jīng)系統(tǒng)輻射損傷中KLF4既能調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞G1/S期和G2/M期周期過(guò)渡，它有沒(méi)有逆向參與星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA損傷或其修復(fù)的功能呢？也就是說(shuō)KLF4在星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA損傷中扮演的角色究竟是損傷還是損傷修復(fù)？KLF4作為具有正性和負(fù)性轉(zhuǎn)錄作用的轉(zhuǎn)錄因子，在星形膠質(zhì)細(xì)胞受到外界包括電離輻射等各種損傷因素惡變?yōu)樾切渭?xì)胞瘤時(shí)，或在星形膠質(zhì)瘤進(jìn)行放療時(shí)，其所處正常星形

4、膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞瘤微環(huán)境的不同，KLF4在其中充當(dāng)何種角色，它在星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)過(guò)程中是作為轉(zhuǎn)錄激活因子還是轉(zhuǎn)錄抑制因子及其相應(yīng)的分子機(jī)制尚不夠清楚。我們對(duì)于KLF4因子不同功能間的轉(zhuǎn)換，在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的放射損傷中的作用及其相應(yīng)的分子機(jī)制研究，將進(jìn)一步為中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生機(jī)制和放射治療的研究提供新的策略思路。
　　 方法：1我們利用小鼠大腦組織各種細(xì)胞貼壁能力的不同采用差速貼壁及振蕩法原代培養(yǎng)昆明種新生小鼠大

5、腦組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞并將其純化，采用流式細(xì)胞儀鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度。
　　 2給予星形膠質(zhì)細(xì)胞4Gy X射線照射前后采用RT-PCR等方法測(cè)定其KLF4在照射前后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)并比較其差異，采用免疫熒光法測(cè)定其與γ-H2AX這一DNA損傷標(biāo)志蛋白的表達(dá)的共定位程度。
　　 3使用慢病毒導(dǎo)入星形膠質(zhì)細(xì)胞干擾其KLF4后，再給予相同劑量的電離輻射后，采用RT-PCR測(cè)定其KLF4 mRNA在照射前后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)并比較

6、其差異，采用彗星實(shí)驗(yàn)(comet)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA損傷的程度在干擾前后的差異。
　　 4運(yùn)用Western-blot方法，對(duì)比經(jīng)慢病毒干擾KLF-4后的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過(guò)4GY電離輻射后與對(duì)照組之間，細(xì)胞對(duì)DNA損傷的兩種主要修復(fù)方式（以DNA依賴蛋白激酶為主的非同源性末端連接修復(fù)和以ATM為主的同源重組）的主要基因即DNA損傷修復(fù)及腫瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs，其蛋白質(zhì)印跡的差異。
　　 5在以上工作的基礎(chǔ)

7、上，我們做了初步的關(guān)于KLF4在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，為下一步工作即KLF4在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制中的作用做準(zhǔn)備。我們收集了10例正常大腦、4例Ⅱ期腦膠質(zhì)瘤、8例Ⅲ期腦膠質(zhì)瘤、10例Ⅳ期腦膠質(zhì)瘤cDNA，比較了其KLF4 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.采用分離純化原代培養(yǎng)昆明種小鼠的大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞，選擇GFAP作為細(xì)胞鑒定的表面標(biāo)記抗原，獲得的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)90％以上，且細(xì)胞數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需要。
　　 2.給予昆

8、明種小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞4Gy X射線照射后，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)KLF4的表達(dá)與γ-H2AX的表達(dá)不僅在核中有90％的共定位，而且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)強(qiáng)度變化趨勢(shì)一致。
　　 3.原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)慢病毒干擾KLF4基因后，經(jīng)過(guò)4 GyX射線照射后，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其γ-H2AX的mRNA值降低，采用中性彗星實(shí)驗(yàn)(neutralcomet)尾矩顯著減小而堿性彗星實(shí)驗(yàn)(alkaline comet)尾距顯著增長(zhǎng)。

9、　　 4.運(yùn)用Western-blot方法發(fā)現(xiàn)，經(jīng)慢病毒干擾KLF-4后的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過(guò)4GY電離輻射后與對(duì)照組相比，細(xì)胞對(duì)DNA損傷的兩種主要修復(fù)方式（以DNA依賴蛋白激酶為主的非同源性末端連接修復(fù)和以ATM為主的同源重組）的主要基因即DNA損傷修復(fù)及腫瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs，其蛋白質(zhì)印跡均明顯增強(qiáng)。此結(jié)果證實(shí)：Klf4抑制了電離輻射引起的DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)，是通過(guò)抑制細(xì)胞對(duì)DNA損傷的兩種主要修復(fù)方式的主要基因即

10、DNA損傷修復(fù)及腫瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs來(lái)實(shí)現(xiàn)的，干擾KLF-4后，星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)電離輻射后DNA損傷的兩種修復(fù)方式的主要作用基因ATM和DNA-PKCs的損傷修復(fù)及腫瘤抑制作用將明顯加強(qiáng)。
　　 5.比較了正常大腦及各期腦膠質(zhì)瘤Klf4 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示KLF4隨腦膠質(zhì)瘤惡性程度的增加表達(dá)也增加，呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論：我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KLF4這一基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)輻射損傷及修復(fù)中對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞

11、DNA雙鏈斷裂的作用為損傷作用，而對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA單鏈斷裂的作用為損傷修復(fù)作用，與已報(bào)道的其對(duì)纖維原細(xì)胞的作用不同，表明KLF4在不同細(xì)胞環(huán)境中以及在不同的DNA損傷類型及其修復(fù)中扮演了不同的角色。實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了KLF4抑制電離輻射引起的DNA雙鏈斷裂損傷的修復(fù)，是通過(guò)抑制細(xì)胞對(duì)DNA損傷的兩種主要修復(fù)方式的主要基因即DNA損傷修復(fù)及腫瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此外，KLF4與腦膠質(zhì)瘤惡性程度有一定關(guān)聯(lián)，呈正相關(guān)，為