鎖骨顱骨發(fā)育不良綜合征患者的臨床與基礎研究.pdf

1、鎖骨顱骨發(fā)育不良綜合征(Cleidocranial dysplasia,CCD)是一種少見的遺傳性骨骼系統(tǒng)疾病,多為常染色體顯性遺傳方式。該綜合征的致病基因為定位于染色體6p21的成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(RUNX2/CBFa1),研究表明致病基因的堿基突變、大片段缺失、染色體異位、以及亞顯微結(jié)構(gòu)的變異是導致此綜合征發(fā)生的分子學病因。鎖骨顱骨發(fā)育不良可以影響膜性成骨、軟骨成骨、以及牙齒的發(fā)育,其主要的臨床表現(xiàn)為:鎖骨的缺如/發(fā)育不全、囟門

2、延遲閉合/開張、沃姆氏骨、恒牙遲萌、多生牙、以及其它骨骼異常。在所有臨床表型中,因顱面部骨骼、牙齒的發(fā)育異常所造成的咀嚼功能障礙、面部畸形對患者的影響最大,是患者自覺發(fā)現(xiàn)的主要癥狀,也是患者就診的主要原因。
　　目前,鎖骨顱骨發(fā)育不良的臨床工作重點、以及難點是對于該病的早期診斷以及錯合畸形的矯治;研究工作的熱點是應用分子生物學、生物信息學的技術、方法探討分子學病因與機制。本研究通過對8例鎖骨顱骨發(fā)育不良患者的顱頜面特征、以及治療進

3、行回顧性研究,為臨床早期診斷的確立提供幫助,并指導臨床開展序列治療、以提高治療的效果;對收集的4個鎖骨顱骨發(fā)育不良家系進行RUNX2基因突變研究、以及蛋白結(jié)構(gòu)、亞細胞定位功能的研究,以進一步探討鎖骨顱骨發(fā)育不良患者的發(fā)病原因,并為下一步開展遺傳咨詢、基因診斷以及產(chǎn)前診斷打下基礎。本文內(nèi)容分為三部分:
　　第一部分鎖骨顱骨發(fā)育不良綜合征患者的臨床表型特征及序列治療
　　對臨床收集的來自4個不同家系的該病的疑似患者進行病史采集、

4、詳細的口腔檢查、并結(jié)合X線檢查了解患者全身骨骼、牙齒發(fā)育情況,以確立臨床診斷。結(jié)果可見所有患者均具有顱骨、鎖骨、牙齒發(fā)育異常的典型“三聯(lián)征”表現(xiàn),故臨床明確診斷為鎖骨顱骨發(fā)育不良綜合征。所有患者的胸骨、骨盆、手、足也表現(xiàn)許多不典型的體征,充分說明此病是以顱骨、鎖骨為主的廣泛的骨骼發(fā)育異常?；颊叩呐R床表型變異性較大,在不同家系之間和同一家系的不同患者之間,都存在較大的表型差異。
　　為了全面認識鎖骨顱骨發(fā)育不良患者的顱面部特征,對8

5、例青少年患者的臨床資料(面像、頭顱定位側(cè)位片、全口曲面斷層片)進行回顧性分析。采用頸椎骨齡分析法,依據(jù)頭顱定位側(cè)位片的第二、三、四頸椎的形態(tài)分析患者的骨齡,結(jié)果顯示:4例患者處于生長發(fā)育高峰前期CS-2或高峰期CS-3,其它4例患者的生長發(fā)育基本完成,處于CS-5或CS-6期。采用“三庭五眼”、“大三庭”、“小三庭”的面部比例劃分標準,分析患者的面像,觀察包括眼部(眼裂形態(tài)、眼眶距離),面部(突度、高度),額部(外形、突度)的顏面特征,

6、結(jié)果顯示:8例患者都表現(xiàn)眼裂傾斜,7例表現(xiàn)兩眶距增寬;8例都表現(xiàn)前額部隆起,2例的前額正中出現(xiàn)凹陷;面中發(fā)育不足、面下高度比例不調(diào)在生長發(fā)育高峰期或前期的患者表現(xiàn)不明顯,在生長發(fā)育基本完成的患者明顯表現(xiàn)。通過全口曲面斷層片、頭顱定位側(cè)位片觀察包括下頜體部、下頜升支部、下頜角部的下頜特征,以及額骨、枕骨、鼻骨、顱底形態(tài),并進行頭影測量分析,結(jié)果顯示:所有患者的喙突指向上方或后上方,下頜升支的前后緣向上平行/接近平行,枕骨出現(xiàn)沃姆氏骨,額骨

7、不同程度隆起,下頜角不同程度缺失(程度嚴重者下頜形似“香蕉”),顱底蝶鞍部后凸;7例患者的鼻骨明顯發(fā)育不足。頭影測量分析顯示:表示上下頜相對位置關系的測量指標(ANB角、Wits距、以及NA-PA)在生長發(fā)育完成的4例患者中都明顯減小,在生長發(fā)育早期的4例患者中有輕度減小;所有患者的上頜長度、上頜位置、以及上面高、上面高與全面高的比值都減小,頜骨發(fā)育異常程度在生長發(fā)育完成的患者中表現(xiàn)較重。本研究說明除了上頜發(fā)育不足的面部異常未在生長發(fā)育

8、早期的兒童明顯表現(xiàn)外,其它部位的異常如多生牙,枕骨沃姆氏骨、鼻骨發(fā)育不足、喙突異常、眼距增寬等表現(xiàn)可在全部/大部患者中均有不同程度的表現(xiàn),可為口腔醫(yī)生對該病的早期診斷提供參考。對患者治療的回顧分析,可見患者伴有廣泛的恒牙萌出異常、嚴重的錯合畸形、以及頜骨發(fā)育異常;口腔治療較為復雜、難度較大,治療周期較長,需要口腔各學科的聯(lián)合矯治。以恢復咀嚼功能、改善面部美觀為目的,可以對鎖骨顱骨發(fā)育不良的患者進行序列治療,分為四個階段:一期,大致年齡7

9、-10歲,去除恒牙萌出障礙,定期觀察牙齒萌出情況,待恒牙自發(fā)萌出;二期,大致年齡10-12歲,前牙牙根發(fā)育完成2/3,以促進前牙萌出、頜骨發(fā)育,為后續(xù)恒牙的萌出提供良好環(huán)境為目的,進行正畸牙齒矯治與早期頜骨矯形治療。三期,大致年齡12-14歲,以促進尖牙/前磨牙萌出、頜骨發(fā)育,恢復牙齒功能為目的,進行正畸牙齒矯治與頜骨矯形治療。四期,18-20歲,以糾正面部畸形,恢復口腔功能、美觀為目的,進行成人正畸正頜聯(lián)合治療、以及義齒修復。雖然每一

10、患者具體的矯治方案因人而異,但是對于此病的序列治療目標、措施的制定,無疑對臨床的治療具有重要的指導意義。
　　第二部分鎖骨顱骨發(fā)育不良綜合征患者的基因診斷
　　對臨床收集到的4個鎖骨顱骨發(fā)育不良綜合征家系進行聚合酶鏈式反應,DNA直接測序檢測RUNX2基因突變,結(jié)果在1個家系的患者中未檢測到RUNX2基因的位點突變;3個家系的患者中檢測到不同的RUNX2基因的堿基突變,分別為:家系Ⅰ的突變體c.243-260 del18(p

11、.81-86del6)是在exon1的Q/A功能域的堿基缺失突變;家系Ⅱ的突變體c.1200C>A(p.stop400)是在exon7的NMTS區(qū)的終止密碼子突變;家系Ⅲ的突變體c.674G>T(p.R225L)是位于exon3的NLS域的錯義突變。其中,家系Ⅰ、Ⅱ的突變是本次研究中檢測到的新的突變位點;家系Ⅲ的突變是國內(nèi)外文獻報道突變頻率最高的位點。本研究結(jié)果進一步證明RUNX2基因的突變是鎖骨顱骨發(fā)育不良的主要分子病因,并為國內(nèi)外鎖

12、骨顱骨發(fā)育不良的突變位點數(shù)據(jù)庫增添了新的資料。
　　對于RUNX2基因突變檢測未發(fā)現(xiàn)突變位點的家系患者,通過實時定量PCR進行了拷貝數(shù)變異的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)此家系患者RUNX2基因的全部外顯子拷貝數(shù)明顯降低,說明 RUNX2基因的全部外顯子缺失的雜合性突變是該家系發(fā)病的分子病因。本實驗證明 RUNX2基因亞顯微結(jié)構(gòu)的拷貝數(shù)變異是鎖骨顱骨發(fā)育不良的又一分子病因;實時定量 PCR方法操作簡單、方便,結(jié)果敏感可靠,可以用于鎖骨顱骨發(fā)育不良

13、拷貝數(shù)變異的首選方法。
　　聯(lián)合應用PCR-DNA測序和實時定量PCR兩種分子遺傳學檢測方法,可以建立一個突變檢測的技術平臺,對于鎖骨顱骨發(fā)育不良患者遺傳學基因的診斷具有廣闊的臨床應用前景。
　　第三部分基因突變對RUNX2蛋白三維構(gòu)象與亞細胞定位影響的研究
　　為研究 RUNX2基因的堿基突變對蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響,應用已有的生物信息學資源、借助相關生物信息學軟件,對 RUNX2基因的突變體蛋白結(jié)構(gòu)進行了預測分析。Sw

14、iss-Model同源模建法預測,結(jié)果顯示:錯義突變體c.674G>T(p.R225L)的蛋白二級結(jié)構(gòu)無明顯改變,由于親水性的精氨酸為疏水性的亮氨酸所替代,引起分子內(nèi)氫鍵基團的丟失,以及分子表面靜電勢能的改變。I-TASSER綜合模建法預測,結(jié)果顯示:堿基缺失突變體c.243-260 del18(p.81-86del6)由于發(fā)生6個氨基酸的缺失,使蛋白的二級和三級構(gòu)象發(fā)生明顯改變,丟失了部分螺旋及折迭結(jié)構(gòu);終止密碼子突變體c.1200C

15、>A(p.stop400),由于氨基酸的部分缺失、蛋白發(fā)生截短、出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)變化,丟失了所有的折迭結(jié)構(gòu)以及大部分轉(zhuǎn)角。本實驗證明RUNX2突變體氨基酸序列的改變影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),從而可能改變蛋白的自身穩(wěn)定性/功能、以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用,使蛋白的正常生理功能受到影響,最終導致鎖骨顱骨發(fā)育不良的發(fā)生及發(fā)展。
　　為研究 RUNX2基因突變體蛋白是否存在亞細胞定位功能的異常,通過構(gòu)建包含突變體與野生型蛋白的真核表達載體,借助

16、細胞轉(zhuǎn)染,觀察 pEGFP-Nl-RUNX2載體轉(zhuǎn)染組細胞的熒光蛋白表達情況,結(jié)果顯示:在野生型RUNX2組的轉(zhuǎn)染細胞中,綠色熒光蛋白僅在胞核中表達;引入突變位點的c.243-260del18(p.81-86del6)與c.1200C>A(p.stop400)兩組,綠色熒光蛋白的表達情況與野生型相同,也是完全在胞核內(nèi)表達;引入c.674G>T(p.R225L)的突變組轉(zhuǎn)染細胞,在胞漿、胞核內(nèi)均可見綠色熒光。本研究結(jié)果再次證明p.R225