家族性顱骨鎖骨發(fā)育不良綜合征患者臨床特點(diǎn)和發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　顱骨鎖骨發(fā)育不良綜合征(Cleidocranial dysplasia，CCD)是一種罕見的常染色體顯性遺傳性疾病(OMIM:119600)，發(fā)病率約為1/1，000，000，性別和年齡無差異。CCD最典型的臨床特征是囟門閉合遲緩或不閉合;鎖骨發(fā)育不全;乳牙滯留、埋伏牙和多生牙。成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor2，RUNX2)被確定為CCD的致病基因。該基因在成

2、骨細(xì)胞的分化和軟骨細(xì)胞的成熟過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　目前，對(duì)于CCD的診斷和治療是臨床工作的難點(diǎn);利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)深入探討CCD的發(fā)病機(jī)制是研究工作的熱點(diǎn)。近年來盡管CCD患者的RUNX2基因突變位點(diǎn)陸續(xù)被報(bào)道，但是此疾病致病基因篩選工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。本研究通過對(duì)一個(gè)CCD家系患者的顱頜面特征進(jìn)行分析，為臨床對(duì)該疾病的診斷提供幫助;并對(duì)該家系進(jìn)行RUNX2基因突變位點(diǎn)的篩查以及體外功能性研究，在分子和蛋白水平進(jìn)

3、一步探討CCD患者的發(fā)病機(jī)制，為遺傳咨詢和基因診斷的開展打下基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.以一個(gè)中國(guó)廣州的CCD家系成員為研究對(duì)象，對(duì)患病成員進(jìn)行病史采集和記錄（包括口腔和大體檢查以及影像學(xué)檢查），并分析患者顱面部軟硬組織特征。
　　2.采用酚/氯仿法提取家系成員外周血DNA，通過Sanger測(cè)序技術(shù)以及家系共分離等方法，確定致病基因與突變位點(diǎn)。
　　3.使用高分辨率熔煉曲線（High Resolution Mel

4、ting，HRM）技術(shù)篩查當(dāng)?shù)厝巳?00份隨機(jī)樣本，確定RUNX2基因突變位點(diǎn)的突變頻率。
　　4.采用Trizol法提取外周血細(xì)胞總RNA，利用qRT-PCR來檢測(cè)家系中正常人與患者外周血中RUNX2基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。
　　5.使用結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件SOPMA和I-TASSER分別預(yù)測(cè)RUNX2突變蛋白的二級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象。
　　6.將人類UNX2基因正常轉(zhuǎn)錄本與異常轉(zhuǎn)錄本的cDNA克隆到載體pEGFP-C1上，利用

5、lipo2000轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中后提取細(xì)胞的總RNA和總蛋白，采用qRT-PCR和Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)野生型和突變型重組載體轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞后RUNX2mRNA和其蛋白表達(dá)水平的差異。
　　7.利用上一步中已轉(zhuǎn)染好的HEK-293T細(xì)胞，用DAPI染核技術(shù)染核，于共聚焦顯微鏡下觀察拍照，比較野生型與突變型融合蛋白在細(xì)胞中表達(dá)部位的差異。
　　結(jié)果：
　　1.該CCD家系患者臨床特征

6、
　　先證者表現(xiàn)出典型的CCD特征，包括口腔異常（乳牙滯留、大量埋伏牙和多生牙）和鎖骨發(fā)育不良。頜面部也表現(xiàn)出特征性改變，表現(xiàn)為眼距增寬，鼻梁塌陷，面中部發(fā)育不足;頭影測(cè)量分析表明上頜骨發(fā)育不足，下頜前突。先證者胞姐表現(xiàn)出類似的頜面部特征。
　　2.確定突變位點(diǎn)
　　Sanger測(cè)序結(jié)果顯示該家系患病成員RUNX2基因編碼區(qū)的第1271位堿基C發(fā)生了缺失(c.1271delC)，該突變位點(diǎn)位于7號(hào)外顯子編碼的核基質(zhì)定位

7、信號(hào)區(qū)(NMTS，subnuclear matrix targeting signal)，突變最終引起了39個(gè)氨基酸的缺失。在該家系正常成員以及當(dāng)?shù)?00份隨機(jī)外周血樣本中均未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變。
　　3.體內(nèi)mRNA水平分析
　　qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在患者和該家系健康人的外周血中RUNX2基因mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有明顯的差異。
　　4.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析
　　蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示突變蛋白丟失了部分β轉(zhuǎn)角、

8、β折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)而增加了α螺旋結(jié)構(gòu)。I-TASSER綜合建模法預(yù)測(cè)結(jié)果顯示堿基缺失突變體c.1271delC，其蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。
　　5.體外mRNA和蛋白表達(dá)水平分析
　　qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示野生型與突變型重組載體轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞后RUNX2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量沒有明顯的差異;Western blot結(jié)果顯示突變型RUNX2融合蛋白表達(dá)水平高于野生型融合蛋白(p＜0.001)。

9、　　6.亞細(xì)胞定位功能
　　亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示野生型RUNX2融合蛋白僅在胞核中表達(dá);而突變型RUNX2融合蛋白中在胞漿、胞核內(nèi)均可見綠色熒光。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)中先證者表現(xiàn)出CCD典型的口腔異常（乳牙滯留、埋伏牙和多生牙）和鎖骨發(fā)育不良，頜面部也具有特征性的改變，包括眼距增寬、面中部發(fā)育不足以及下頜前突等。
　　2.本實(shí)驗(yàn)在一個(gè)CCD家系患者的RUNX2基因上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的移碼突變c.1271delC