過氧化氫誘導(dǎo)雞心肌細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡指由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)和調(diào)控的改變。心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，增殖能力極弱，在胚胎期后期，其數(shù)量就幾乎不再增長。凋亡和壞死是心肌細(xì)胞數(shù)量減少的最主要原因，心肌數(shù)量減少后難以恢復(fù)，進(jìn)而逐步降低心肌細(xì)胞的功能，形成心衰等癥狀。雞的不少疾病病程中也伴隨著明顯的心肌細(xì)胞凋亡和損傷，心肌細(xì)胞的凋亡甚至成為某些疾病的始動因素，如腹水綜合征等疾病。因此，凋亡在雞心肌細(xì)胞中占有非常重要的地位。
　　轉(zhuǎn)

2、錄組測序可以將特定細(xì)胞在某一狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA，包括mRNA和非編碼RNA全部高通量測序。它是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點，通過新一代高通量測序，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，并忠實反映出細(xì)胞內(nèi)所有基因表達(dá)的變化。
　　目前，哺乳動物心肌細(xì)胞凋亡的研究已經(jīng)比較充分，近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了越來越多的凋亡或凋亡阻抑分子，發(fā)掘了大量的凋亡信號通路，其作用機理也研究得比較充分。但

3、雞心肌細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究開展較少，其很多重要分子沒有被發(fā)現(xiàn)，凋亡通路也沒有完善，其具體的凋亡和凋亡阻抑也不能直接套用哺乳動物的研究結(jié)果。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的特性，將可以一站式的解決這些問題。
　　為了補充上述雞心肌細(xì)胞凋亡研究方面的不足，理清雞心肌細(xì)胞凋亡中的各個環(huán)節(jié)，找出其具體的凋亡通路，構(gòu)建凋亡的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，開展了以下的試驗研究:
　　1.雞心肌原代細(xì)胞培養(yǎng)鑒定與凋亡誘導(dǎo)試驗
　　為建立雞心肌原代細(xì)胞培養(yǎng)模型和獲

4、得穩(wěn)定、高純度的雞心肌原代細(xì)胞，并初步探討凋亡誘導(dǎo)條件，采用14d白來航雞胚，細(xì)致分離其心室肌，剪碎，0.05％胰酶消化，吹打，離心收獲細(xì)胞，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，30min差速貼壁轉(zhuǎn)接24孔板，6h后洗滌1次，培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、免疫組化檢測鑒定和肌球蛋白PCR鑒定。獲得的細(xì)胞用0.1-1.6 mM梯度過氧化氫誘導(dǎo)凋亡，檢測凋亡出現(xiàn)的時間和凋亡基因表達(dá)的變化，結(jié)果顯示胰酶消化法可以獲得很高純度的心肌細(xì)胞，細(xì)胞呈大三角形，持續(xù)培

5、養(yǎng)下具有多形性。a-actin免疫組化鑒定為陽性，肌球蛋白PCR鑒定陽性，細(xì)胞可以穩(wěn)定生長15天以上。在0.2mM過氧化氫誘導(dǎo)下，經(jīng)過9h，雞心肌原代細(xì)胞發(fā)生明顯細(xì)胞凋亡，凋亡相關(guān)基因的表達(dá)達(dá)到峰值，可用于后期凋亡誘導(dǎo)試驗。
　　2.轉(zhuǎn)錄組測序鑒定過氧化氫誘導(dǎo)的雞心肌細(xì)胞凋亡應(yīng)答
　　為了解雞心肌細(xì)胞凋亡下各種應(yīng)答、建立凋亡相關(guān)通路，培養(yǎng)雞心肌原代細(xì)胞，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，提取RNA并進(jìn)行該心肌細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄本測序，并與正常組進(jìn)行

6、對比。通過RNAseq，我們總共發(fā)現(xiàn)19268個轉(zhuǎn)錄本和2160個新基因，而在凋亡進(jìn)程中，總共有6148基因發(fā)生明顯差異表達(dá)，其中14.5％的表達(dá)上調(diào)和17.5％的表達(dá)下調(diào)。通過對測序分析，總共富集了152條信號通路，其中，絕對多數(shù)是合成和代謝相關(guān)的通路，但也有一些直接是凋亡信號通路。合成和代謝相關(guān)的通路主要包括:“脂肪酸代謝”、“丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸的代謝”、“不飽和脂肪酸生物合成”、“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工”等，和凋亡直接相關(guān)的信號通

7、路的激活主要包括:“PPAR信號通路”、“脂肪細(xì)胞因子信號通路”、“TGF-beta信號通路”、“Toll樣受體信號通路”、“MAPK信號通路”、“p53信號通路”和“Wnt信號通路”。除了這兩大類通路以外，我們發(fā)現(xiàn)，其他一些通路也明顯被激活，如“Regulation of actin cytoskeleton”和“cell cycle”。從通路篩選的情況來看，過氧化氫誘導(dǎo)不僅僅形成了凋亡，而且過氧化氫的細(xì)胞毒性也明顯影響了細(xì)胞的各種功