熱休克蛋白對過氧化氫所致心肌細胞凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、該研究采用0.5mmol/L過氧化氫(hydrogen peroxide,H<,2>O<,2>)分別作用于原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞和C<,2>C<,12>細胞以誘導細胞凋亡,探討膜死亡受體通路和線粒體通路在其中的作用.在此基礎上,通過熱休克誘導或基因轉(zhuǎn)染增加細胞中熱休克蛋白的表達,觀察熱休克蛋白對過氧化氫所致細胞凋亡的抑制作用并探討其與上述兩條信號通路的關系.主要實驗結(jié)果如下:1、H<,2>O<,2>誘導心肌細胞和C<,2>C<,12

2、>細胞凋亡的機制研究.經(jīng)原位缺口末端標記和Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn),暴露于0.5mmol/L H<,2>O<,2> 24h后,心肌細胞和C<,2>C<,12>細胞均出現(xiàn)明顯凋亡;Caspase活性定量檢測和Western-blot顯示,H<,2>O<,2>處理4h后,心肌細胞和C<,2>C<,12>細胞中Caspase-3,8,9的活性均明顯增高;通過差速離心法分離胞漿和線粒體成分后作Western-blot檢測,以及通過間接

3、免疫熒光觀察,發(fā)現(xiàn)H<,2>O<,2>處理心肌細胞和C<,2>C<,12>細胞2h后,細胞色細胞內(nèi)Bid大量裂解成tBid.2、熱休克反應抑制H<,2>O<,2>所致心肌細胞和C<,2>C<,12>細胞凋亡的機制研究.Western-blot顯示心肌細胞和C<,2>C<,12>細胞經(jīng)熱休克反應后,HSP70與αB-晶狀體蛋白的表達明顯增加;經(jīng)流式細胞術和Hoechst 33258染色檢測發(fā)現(xiàn),熱休克反應可顯著減少H<,2>O<,2>所致

4、的細胞凋亡;Caspase活性定量檢測和Western-blot顯示,當細胞經(jīng)熱休克反應后再暴露于H<,2>O<,2>時,各時間點的Caspase-3,8,9活性均明顯低于H<,2>O<,2>損傷組;通過差速離心法分離胞漿和線粒體成分后分別作Western-blot檢測顯示,熱休克反應可明顯抑制細胞色素C從線粒體向胞漿的移位;Western-blot檢測顯示,熱休克反應明顯抑制H<,2>O<,2>所致C<,2>C<,12>肌原細胞中的B

5、id裂解成tBid.3、HSP70抑制H<,2>O<,2>所致C<,2>C<,12>肌原細胞凋亡的機制研究.構(gòu)建pcDNA3.1-HSP70重組質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HSP70及對照質(zhì)粒pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染C<,2>C<,12>肌原細胞36h,經(jīng)Western-blot分析證明轉(zhuǎn)HSP70基因可明顯增加細胞內(nèi)HSP70蛋白的表達;Hoechst 33258染色后計數(shù)凋亡核百分率以及DNA"梯狀"條帶檢測均顯示,HSP70

6、過表達可抑制H<,2>O<,2>所致的C<,2>C<,12>肌原細胞凋亡;經(jīng)Western-blot分析證明,HSP70過表達可明顯抑制H<,2>O<,2>所致的Caspase-3,8,9活化和Bid裂解成tBid.綜上所述,在H<,2>O<,2>所致的心肌細胞和C<,2>C<,12>細胞凋亡中,膜死亡受體通路和線粒體通路均發(fā)揮了重要作用,兩條通路又通過tBid進行溝通.熱休克反應以及HSP70通過干預上述兩條通路而抑制H<,2>O<,