三七人參皂甙-Rd對過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠基底動脈平滑肌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、高血壓是腦卒中的首要危險因素。在各種引起腦卒中的常見原因中，由高血壓引起的腦卒中，占到腦卒中的一半以上。高血壓發(fā)展過程中出現(xiàn)的血管重構(gòu)是引起腦卒中、心肌梗死等高血壓并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)。血管重構(gòu)可分為正常向心性重構(gòu)(eutrophic inward remodeling)和肥厚向心性重構(gòu)(hypertrophic inward remodeling)兩種。血管重構(gòu)的機(jī)制涉及血管壁細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、炎癥、以及纖維化等。其中，血管平滑肌細(xì)

2、胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖與凋亡的失平衡是高血壓血管重構(gòu)的經(jīng)典機(jī)制之一。
　　 細(xì)胞凋亡(apoptosis)作為生長發(fā)育過程中的一種精細(xì)調(diào)控機(jī)制，是由基因調(diào)控的一種主動死亡形式，是生命的基本現(xiàn)象之一?；钚匝?Reactive oxygen species，ROS)包括超氧陰離子(·O2)、過氧化氫(H2O2)、和羥基陰離子(OH-)，可以誘導(dǎo)包括平滑肌細(xì)胞凋亡在內(nèi)的一系列細(xì)胞

3、內(nèi)事件，從而參與許多心血管疾病的發(fā)生，這其中就包括高血壓、動脈粥樣硬化、高脂血癥、心肌梗塞、心力衰竭和糖尿病等。目前通常認(rèn)為有兩條經(jīng)典的凋亡通路，即內(nèi)源性及外源性通路，兩條通路最終匯聚于caspase-3蛋白的激活并導(dǎo)致核降解和特異性的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　 三七人參皂甙-Rd(panax ginsenoside-Rd)是從三七總皂甙中提取的一種單體有效成分，分子量為1001.2，分子式為C48H82O18·3H2O。本實(shí)驗(yàn)室的

4、研究顯示三七人參皂甙-Rd是受體操縱性Ca2+通道(receptor-operated calcium channels，ROCC)、Ca2+池操縱性Ca2+通道(store-operated calcium channels，SOCC)特異性的阻斷劑，可以抑制ET-1誘導(dǎo)的大鼠腦基底動脈平滑肌細(xì)胞田asilarArtery Smooth MuscleCells，BASMCs)的增殖，同時研究也表明三七人參皂甙-Rd可以明顯抑制高血壓過

5、程中大鼠腦基底動脈和大腦中動脈的重構(gòu)。基于本實(shí)驗(yàn)室已有的工作，本實(shí)驗(yàn)將就三七人參皂甙-Rd對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡的影響進(jìn)行探討。將進(jìn)行的主要工作有：建立H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡模型；觀察預(yù)孵三七皂甙-Rd后對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡的影響；初步探討三七人參皂甙-Rd影響H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的機(jī)制，為三七人參皂甙-Rd預(yù)防高血壓腦卒中并抑制其發(fā)展過程中出現(xiàn)的腦血管重構(gòu)的現(xiàn)象提供更

6、多的證據(jù)。
　　 一.原代培養(yǎng)大鼠BASMCs的鑒定及H2O2誘導(dǎo)大鼠BASMCs凋亡模型的建立
　　 本實(shí)驗(yàn)在原代培養(yǎng)的大鼠BASMCs上進(jìn)行，用細(xì)胞免疫熒光法染色對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。氧化應(yīng)激造成的大量ROS的產(chǎn)生及其繼發(fā)性細(xì)胞損傷與VSMCs凋亡過程密切相關(guān)。其中H2O2被認(rèn)為是主要的氧化信號介導(dǎo)者。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已有工作確定200μmol·L-1 H2O2處理細(xì)胞24h建立穩(wěn)定凋亡模型。
　　 結(jié)果:
　　

7、 1.原代培養(yǎng)的大鼠BASMCs相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈梭形或長梭形，圍繞于組織塊周圍，呈“峰，谷”狀高低起伏排列。平滑肌特異的α-actin抗體細(xì)胞免疫熒光法染色，可見胞質(zhì)中細(xì)絲狀紅色陽性反應(yīng)物，純度＞95％，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.200μtmol·L-1H2O2處理細(xì)胞24h，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kits-8，CCK-8)檢測細(xì)胞存活率為75.4士5.0％，流式細(xì)胞AnnexinV/PI雙

8、染法測得細(xì)胞早期凋亡率20.9士3.8％(n=6，*p＜0.05，vs.control group)，Hoechst33258核染色可見凋亡小體，說明外源性給予H2O2處理大鼠BASMCs24h，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。故本實(shí)驗(yàn)選擇此條件誘導(dǎo)大鼠BASMCs凋亡，建立模型，為后面深入研究三七人參皂甙-Rd對H2O2誘導(dǎo)大鼠BASMCs凋亡的影響奠定基礎(chǔ)。
　　 二.三七人參皂甙-Rd對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡的影響
　　

9、 本實(shí)驗(yàn)利用CCK-8測定細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞早期凋亡率，Hoechst33258核染色法分析三七人參皂甙-Rd對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組、溶媒處理組、三七人參皂甙-Rd處理組、H2O2處理組、溶媒預(yù)孵H2O2處理組和三七人參皂甙-Rd預(yù)孵H2O2處理組，共六組。
　　 結(jié)果:
　　 1.CCK-8檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示1.25～20μmol·

10、L-1三七人參皂甙-Rd預(yù)孵30分鐘H2O2處理24h，大鼠BASMCs的存活率依次為68.4士3.1％，65.2±1.7％，59.3士2.2％，46.0士3.2％，34.0±1.2％，三七人參皂甙-Rd可以濃度依賴性降低H2O2處理的大鼠BASMCs的存活率，IC50=9.65±0.88μmol·L-1，此結(jié)果與三七人參皂甙-Rd抑制ET-1誘導(dǎo)的大鼠BASMCs的IC50值(10.88+2.06μmol·L-1)較吻合，故接下來的實(shí)

11、驗(yàn)三七人參皂甙-Rd劑量均選用10μmol·L-1。
　　 2.用CCK-8檢測三七人參皂甙-Rd對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs存活率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后存活率為75.4士5.0％，三七人參皂甙-Rd預(yù)孵30分鐘H2O2處理24h，細(xì)胞存活率為46.0士3.2％(n=6，＃P＜0.05 vs.H2O2treated group)，而溶媒預(yù)孵30分鐘H2O2處理組細(xì)胞存活率為73.8±4.2％，與H2O2處理組

12、相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=6，P＞0.05 vs.H2O2 treated group)。
　　 3.Hoechst33258核染色法檢測顯示，與H2O2處理組相比，三七人參皂甙-Rd預(yù)孵30分鐘，H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs中出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞數(shù)明顯增多，形態(tài)學(xué)改變明顯加重；而溶媒預(yù)孵30分鐘H2O2處理組凋亡形態(tài)學(xué)改變無明顯差異。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙染法定量檢測凋亡率顯示，H2O2誘導(dǎo)的大鼠BAS

13、MCs早期凋亡率為20.9+3.8％(n=6，*p＜0.05，vs.control group)，三七人參皂甙-Rd預(yù)孵30分鐘，H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs早期凋亡率為31.5士3.6％(n=6，＃p＜0.05，vs.H2O2 treatedgroup)，而溶媒預(yù)孵30分鐘，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡率為21.1±4.0％，與H2O2組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=6，P＞0.05vs.H2O2 treated group)。
　　 三

14、.三七人參皂甙-Rd對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響本實(shí)驗(yàn)利用western blot和confocal image等方法檢測三七人參皂甙-Rd對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡過程中caspase-3，caspase-9，caspase-8，cytochrome C，Bcl-2，Bax，線粒體膜電位等凋亡相關(guān)蛋白及因子的影響。實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組、溶媒處理組、三七人參皂甙-Rd處理組、H2O2處理組、溶媒預(yù)孵H

15、2O2處理組和三七人參皂甙-Rd預(yù)孵H2O2處理組，共六組。
　　 結(jié)果:
　　 1、三七人參皂甙-Rd對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡過程中caspase-3蛋白的影響
　　 2、三七人參皂甙-Rd對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡過程中caspase-8蛋白的影響
　　 3、三七人參皂甙Rd對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡過程中caspase-9蛋白的影響
　　 4、三七人參皂甙-R

16、d對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡過程中線粒體膜電位(△ψm)的影響
　　 5、三七人參皂甙-Rd對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡過程中cytochrome C蛋白的影響
　　 6、三七人參皂甙-Rd對H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡過程中Bcl-2蛋白和Bax蛋白的影響
　　 結(jié)論
　　 1.三七人參皂甙-Rd促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡。
　　 2.三七人參皂甙-Rd通過影

17、響細(xì)胞凋亡的線粒體途徑促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的大鼠
　　 BASMCs的凋亡，而非受體通路。
　　 3.三七人參皂甙-Rd通過作用于線粒體凋亡途徑的重要調(diào)節(jié)因子Bel-2家族蛋白來影響細(xì)胞凋亡的線粒體途徑，并最終促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的大鼠BASMCs凋亡。
　　 統(tǒng)計(jì)方法
　　 對本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS for windows11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析等，不同實(shí)驗(yàn)組內(nèi)差異的顯著性，如各組間方差齊采用方差分析S-