引流頸部淋巴結(jié)在大鼠角膜移植免疫中作用的實驗研究.pdf

1、角膜移植手術(shù)是目前世界上最具代表性的器官移植術(shù)。在我國,單眼和雙眼角膜盲約有400～500萬,其中約80％可以通過角膜移植手術(shù)脫盲。目前,我國每年約實施5000例角膜移植手術(shù),顯而易見,這遠遠不能滿足實際需要。限制手術(shù)大量廣泛開展的因為,除了供體角膜來源缺乏及中長期保存方法欠缺外,臨床眼科醫(yī)師直接面臨的難題,是如何抑制免疫排斥反應,提高角膜移植片的存活率[1]。
　　 “低?！苯悄みM行同種異體角膜移植術(shù)后,在經(jīng)典的類皮質(zhì)甾酮治療

2、條件下,大部分植片都能得到存活。但是,這種激素治療通常會導致青光眼、白內(nèi)障及機會性感染等并發(fā)癥的發(fā)生[2]。另外,高危角膜移植(包括受體角膜血管化、持續(xù)炎癥、再次移植等)數(shù)量正呈不斷上升的趨勢,而即便是局部和全身應用免疫抑制劑,高危角膜移植植片存活率仍低于50％。因此,探明同種異體角膜移植免疫排斥反應的發(fā)生機制,尋找更為有效安全的抗排斥方法成為角膜基礎(chǔ)研究的焦點[3]。
　　 早期的研究已經(jīng)提出免疫赦免這一概念。Streilei

3、n等提出的現(xiàn)代概念是:進入特殊部位的抗原并沒有隱匿,而是逸入全身血液循環(huán)。但是這些抗原所激發(fā)的全身性免疫誘導過程可被該部位的一些局部特征修飾,從而抑制免疫原性炎癥的出現(xiàn)[3]。免疫赦免狀態(tài)的維持與以下眼部特征有關(guān):首先:“被動”特征,如血-眼屏障、缺乏淋巴引流途徑、眼部實質(zhì)細胞很少表達MHCⅠ型或Ⅱ型抗原(減少了T細胞致敏的可能性)；其次:“主動”特征,包括一些眼部細胞特征性表達的分子(如Fas配體和活化的補體成分的膜抑制物)、房水中一

4、系列抑制和調(diào)節(jié)免疫細胞功能的因子(TGF-β,A2黑色素細胞刺激素、血管活性腸肽、降鈣素基因相關(guān)多肽、游離皮質(zhì)醇和IL-1受體拮抗劑等),這些眼部特征最后通過克隆清除、克隆無反應、免疫偏離、T細胞抑制四種途徑誘導對外周抗原特異性T細胞的耐受。其中免疫偏離和T細胞抑制(尤其是免疫偏離)在眼部免疫赦免的形成中起重要作用[3][4]。
　　 Wolvers等人所做的一系列經(jīng)典實驗顯示針對鼻粘膜抗原的免疫耐受誘導完全依賴于頸部淋巴結(jié)的存

5、在[5]。已經(jīng)證實作為二級淋巴器官的頸部淋巴結(jié)引流包括眼部淋巴在內(nèi)的頭面部淋巴,并與粘膜特異性免疫和耐受有關(guān)[2][5][6]。高危角膜移植術(shù)后同種異體反應性細胞毒性T細胞也在頸部淋巴結(jié)產(chǎn)生[2]。近些年國內(nèi)外的一些動物實驗研究顯示切除頸部淋巴結(jié)可以延長同種異體角膜植片的存活時間[7]。但移植排斥反應過程中頸部淋巴結(jié)的免疫及分子生物學方面的作用機制尚未闡明,仍需進一步研究。
　　 本實驗第一部分是建立同側(cè)和雙側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除

6、后角膜移植大鼠模型,術(shù)后與正常大鼠角膜移植比較植片存活情況,并觀察不同處理組各大鼠DTH反應情況,探討引流頸部淋巴結(jié)在大鼠角膜移植中的作用；第二部分建立單純高危角膜移植模型、同側(cè)及雙側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除后高危角膜移植模型,與單純角膜移植相比較,觀察各處理組大鼠角膜植片存活情況及DTH反應情況,探討引流頸部淋巴結(jié)在高危角膜移植中的作用。
　　 研究目的:
　　 1.通過建立大鼠同側(cè)和雙側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除后角膜移植模型及正

7、常大鼠角膜移植模型,觀察角膜HE染色切片,分析同側(cè)和雙側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除對角膜移植后植片生存情況和DTH反應情況的影響,探討引流頸部淋巴結(jié)在角膜移植中的作用。
　　 2.通過建立同側(cè)及雙側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除后高危角膜移植模型,與正常角膜移植及高危角膜移植比較,觀察角膜HE染色切片,分析植片生存情況、DTH反應情況,探討引流頸部淋巴結(jié)切除對高危角膜移植的影響及作用。
　　 研究方法:
　　 1.以健康清潔級Wis

8、tar大鼠為供體,SD大鼠為受體,隨機均分為A、B、C3組:A組正常角膜移植組；B組同側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除并角膜移植組；C組雙側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除并角膜移植組(同側(cè)或雙側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除于角膜移植前2天實施)。角膜移植術(shù)后,裂隙燈顯微鏡下評價植片排斥反應指數(shù)(:rejiectionindex,RI),并于術(shù)后第14天取角膜植片,制作石蠟切片后行HE染色觀察。
　　 2.制取滅活脾細胞懸液,注射于各處理組大鼠后肢右足,磷酸鹽緩沖

9、液注射后肢左足對照,相同處理作用于已經(jīng)滅活脾細胞皮下注射致敏的常規(guī)免疫大鼠,注射24小時后,測量左足及右足足腫厚度,參照文獻運用公式(抗原注射部位足腫厚度-磷酸鹽緩沖液注射部位足腫厚度)計算足腫量作為DTH反應檢測指標,采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。
　　 3.以健康清潔級Wistar大鼠為供體,SD大鼠為受體,隨機均分為A、B、C、D4組:A組正常角膜移植組；B組高危角膜移植組(高危角膜參考文獻以縫線法誘導)；C

10、組同側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除并高危角膜移植組；D組雙側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除并高危角膜移植組(同側(cè)或雙側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除于角膜移植前3天實施)。角膜移植術(shù)后,裂隙燈顯微鏡下評價植片排斥反應指數(shù),術(shù)后第10天取角膜植片,制作石蠟切片后行HE染色,進行觀察。
　　 4.參照2中方法檢測第二部分中DTH反應,探討引流頸部淋巴結(jié)在高危角膜移植中的作用。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.生存時間:
　　 (1)第一部分:A、

11、B、C三組移植片平均生存時間分別為:(10.900±0.994)d；(40.800±1.135)d；(41.500±1.080)d。其中,B組、C組與A組相比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000；P=0.000)；B組和C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.319)。
　　 (2)第二部分:A、B、C、D四組移植片平均生存時間分別為:(10.333±0.816)d:(7.166±0.752)d;(15.166±0.752)d；(15

12、.666±1.032)d。其中,C、D組與B組相比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000；P=0.000)3C和D組與A組相比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000；P=0.000)；C組和D組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.319)；A組和B組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。
　　 2.排斥反應指數(shù)(RI):
　　 (1)第一部分:移植術(shù)后14d,A、B、C三組移植片平均排斥反應指數(shù)分別為:7.40±1.57；3.

13、40±0.84；3.00±0.94。其中,B組、C組與A組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000；P=0.000),B組和C組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.450)。
　　 (2)第二部分:角膜移植術(shù)后14天,A、B、C、D四組移植片平均排斥反應指數(shù)分別為:6.66±1.36;10.16±0.75；6.16±1.16;5.66±1.21。各組之間比較具有顯著性(F=18.987,P=0.000)。其中,B組與A組、C組、D組

14、之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000；P=0.000；P=0.000),C組與A組、D組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.459；P=0.459),A組與D組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.147)。
　　 3.DTH反應:
　　 (1)第一部分:角膜移植術(shù)后14天,各組大鼠DTH反應足腫量測量結(jié)果之間差異具有統(tǒng)計學意義意義(F=34668.21,P=0.000)；B組、C組與常規(guī)免疫組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0

15、00；P=0.000),B組、C組與A組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.008；P=0.001),A組與常規(guī)免疫組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000),B組與C組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.372)。
　　 (2)第二部分:角膜移植術(shù)后14天,各組大鼠DTH反應足腫量測量結(jié)果之間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=9.386,P=0.000)；B組與A組、C組、D組、及常規(guī)免疫組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006；P=0.000；

16、P=0.000；P=0.012),B組與A組、D組、及常規(guī)免疫組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.227；P=0.513；P=0.127),A組與D組、常規(guī)免疫組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.082；P=0.743),D組與常規(guī)免疫組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.043)。
　　 4.HE染色組織切片觀察:
　　 (1)第一部分:A組植片組織水腫,基質(zhì)層明顯增厚,膠原纖維排列紊亂,有較多的新生血管形成及大量的炎性細胞浸潤；B

17、組、C組植片組織水腫增厚,大量炎性細胞浸潤,兩組之間無明顯差異。
　　 (2)第二部分:A組及B組植片組織水腫,基質(zhì)層明顯增厚,膠原纖維排列紊亂,有較多的新生血管形成及大量的炎性細胞浸潤,B組較A組情況重；C組、D組植片大量炎性細胞浸潤,新生血管較A組、B組明顯減少。
　　 結(jié)論:
　　 1.引流頸部淋巴結(jié)切除對大鼠角膜移植免疫排斥反應具有顯著的抑制作用。
　　 2.同側(cè)引流頸部淋巴結(jié)切除與雙側(cè)引流頸部淋

18、巴結(jié)切除對抑制排斥反應的作用效果基本相同；衡量兩側(cè)引流頸部淋巴結(jié),同側(cè)引流頸部淋巴結(jié)在移植免疫中起主要作用。
　　 3.切除引流頸部淋巴結(jié)可能通過抑制同種異體致敏過程,從而阻止同種異體特異性DTH反應的誘導和(或)產(chǎn)生,最終起到保護植片的作用；同側(cè)頸部淋巴結(jié)切除和雙側(cè)淋巴結(jié)切除對植片存活的影響無明顯不同,頸部淋巴結(jié)在角膜移植中的作用主要集中在同測頸部淋巴結(jié)。
　　 4.引流頸部淋巴結(jié)切除對高危角膜移植排斥具有明顯的抑制作