角膜移植后引流淋巴結(jié)CCL19變化及其抗體延長(zhǎng)植片存活的研究.pdf

1、第一部分:角膜移植后局部淋巴引流區(qū)的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探討大鼠角膜移植術(shù)后局部淋巴引流的主要區(qū)域。 方法:建立大鼠同種異體正位穿透性角膜移植模型，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)移植后不同時(shí)間點(diǎn)的同側(cè)頜下淋巴結(jié)(Submandibularlymphnodes，SMLN)、對(duì)側(cè)SMLN、同側(cè)頸淺淋巴結(jié)(Superficialcervicallymphnodes，SCLN)及對(duì)側(cè)SCLN內(nèi)樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC

2、)的數(shù)量及ELISA方法檢測(cè)趨化因子CCL19的表達(dá)變化情況，同時(shí)分別摘除上述各組淋巴結(jié)，分成五組：A組：同種異體正位穿透性角膜移植；B組：同種異體正位穿透性角膜移植+同側(cè)SMLN摘除；C組：同種異體正位穿透性角膜移植+對(duì)側(cè)SMLN摘除；D組：同種異體正位穿透性角膜移植+同側(cè)SCLN摘除；E組：同種異體正位穿透性角膜移植+對(duì)側(cè)SCLN摘除，觀測(cè)各組植片存活及排斥情況。 結(jié)果:大鼠同種異體角膜移植后不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，同側(cè)SMLN內(nèi)趨化

3、因子CCL19的表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，與之相對(duì)應(yīng)的是DC細(xì)胞數(shù)量的增加(P＜0.01)，而同側(cè)SCLN及對(duì)側(cè)SMLN、SCLN內(nèi)上述各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化(P＞0.05)；正常大鼠同種異體正位穿透性角膜移植植片平均存活時(shí)間為(8.25±2.43)d，B組植片存活時(shí)間為(13.54±1.17)d，明顯延長(zhǎng)(P＜0.01)，D組植片存活時(shí)間縮短(5.07±1.25)d，排斥反應(yīng)明顯提前(P＜0.01)，而C組及E組植片存活時(shí)間無(wú)明顯影響(P＞0.05

4、)，分別為(8.36±1.96)d，(8.59±2.04)d。結(jié)論大鼠角膜移植術(shù)后頸部淋巴引流的區(qū)域主要為同側(cè)SMLN；摘除同側(cè)SMLN后植片存活時(shí)間延長(zhǎng)，摘除同側(cè)SCLN后排斥反應(yīng)提前。 第二部分:角膜移植后局部淋巴結(jié)內(nèi)CCL19表達(dá)變化及趨化活性的研究 目的:研究大鼠同種異體穿透角膜移植后同側(cè)SMLN內(nèi)趨化因子CCL19mRNA在不同時(shí)相表達(dá)的變化及淋巴結(jié)組織液對(duì)DC的趨化能力變化，探討趨化因子CCL19在角膜移植中的作

5、用。 方法:分別建立大鼠同種異體正位穿透角膜移植模型及自體原位穿透角膜移植模型，用RT-PCR法分別檢測(cè)正常角膜0d，同種異體角膜移植及自體角膜移植后1d、3d、5d、7d、10d、14d時(shí)的同側(cè)SMLN內(nèi)趨化因子CCL19mRNA的表達(dá)變化；應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)兩種模型在上述時(shí)相時(shí)同側(cè)SMLN內(nèi)DC的數(shù)量變化，并用Boyden小室觀察不同時(shí)相淋巴結(jié)組織液在有和無(wú)抗CCL19抗體下對(duì)體外培養(yǎng)DC的趨化能力的變化。 結(jié)果:

6、正常淋巴結(jié)內(nèi)CCL19mRNA的表達(dá)為0.358±0.072，DC細(xì)胞為0.480±0.056；自體角膜移植術(shù)后，局部淋巴結(jié)內(nèi)CCL19mRNA的表達(dá)及DC的數(shù)量均升高，持續(xù)至術(shù)后第3d(P＜0.05)，以后逐漸恢復(fù)至正常水平(P＞0.05)，同種異體角膜移植后，局部淋巴結(jié)內(nèi)CCL19mRNA的表達(dá)及DC的數(shù)量于術(shù)后1～3d與自體移植組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，以后持續(xù)上升至后期顯著高于正常組及自體移植組，于7d達(dá)高峰(P＜0.01

7、)，分別為2.008±0.124和0.949±0.034，并且不同時(shí)相淋巴結(jié)組織液對(duì)體外培養(yǎng)DC的趨化作用增強(qiáng)(P＜0.05)，這種趨化作用可被抗CCL19抗體所阻斷(P＜0.01)，與植片排斥過(guò)程基本一致。 結(jié)論:正常淋巴結(jié)內(nèi)存在CCL19mRNA的表達(dá)和一定量的DC細(xì)胞；同種異體角膜移植后，同側(cè)SMLN內(nèi)CCL19mRNA表達(dá)持續(xù)增高，促進(jìn)DC不斷遷移進(jìn)入淋巴結(jié)內(nèi)進(jìn)行抗原呈遞，可能是同種異體角膜移植排斥反應(yīng)啟動(dòng)與進(jìn)展的重要因素

8、。 第三部分:角膜移植后抗CCL19抗體延長(zhǎng)植片存活的研究 目的:觀察局部應(yīng)用抗CCL19抗體對(duì)大鼠同種異體穿透角膜移植植片存活的影響作用。 方法:建立大鼠同種異體正位穿透角膜移植模型，將手術(shù)成功者分為A組、B組、C組及對(duì)照D組，均于術(shù)后立即及第術(shù)后3d、5d每只術(shù)眼每次球結(jié)膜下分別注射1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml的抗CCL19抗體0.2ml，對(duì)照組(D組)球結(jié)膜下注射等量的磷酸緩沖液(PBS)，

9、對(duì)植片情況進(jìn)行評(píng)分，觀察其效果，并于術(shù)后10d，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)同側(cè)SMLN內(nèi)DC的數(shù)量，體外單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(mixedlymphocyteresponse，MLR)測(cè)定T細(xì)胞的增殖反應(yīng)情況。 結(jié)果:各實(shí)驗(yàn)組角膜植片平均存活時(shí)間分別為(9.17±2.89)d，(15.75±2.01)d，(20.19±1.88)d，對(duì)照組(8.29±2.57)d，與對(duì)照組平均存活時(shí)間相比，1μg/ml組無(wú)明顯變化(P＞0.05)，而10

10、μg/ml組、25μg/ml組則明顯延長(zhǎng)植片存活時(shí)間(P＜0.01)，且25μg/ml組與10μg/ml組相比差異有顯著性(P＜0.01)；同側(cè)SMLN內(nèi)DC的數(shù)量在10μg/ml組、25μg/ml組明顯減少(P＜0.01)，分別為0.754±0.027和0.521±0.034，而1μg/ml組及對(duì)照組則無(wú)明顯變化(P＞0.05)，分別為0.947±0.033和0.989±0.042；MLR結(jié)果顯示：1μg/ml組及對(duì)照組淋巴結(jié)增殖明顯