血小板活化及其對單核細胞亞群調(diào)控在RA發(fā)病中的作用.pdf

1、目的：
　　類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明，先天和后天多種因素導致的慢性炎性自身免疫疾病。以累及周身關(guān)節(jié)的局部損傷、滑膜炎為主要特征，目前還無法根治。多種炎性細胞及促炎因子參與該病的發(fā)生和發(fā)展，越來越多的研究顯示，血小板除了作為傳統(tǒng)意義上的止血衛(wèi)士外，血小板異?；罨谘装Y和免疫應答過程中也起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。既往國內(nèi)外研究中發(fā)現(xiàn) RA發(fā)病中有血小板過度活化表現(xiàn)，但是,獨立的血小板勢

2、單力薄，很難發(fā)揮強大的致炎功能，但是在與白細胞結(jié)合后,二者發(fā)生粘附聚集，導致表面以及內(nèi)部的多種分子被激活并發(fā)生構(gòu)象改變，由此循環(huán)往復產(chǎn)生的炎癥效應被放大，并且互相影響互相活化。
　　單核細胞作為機體重要的天然免疫細胞群，集吞噬、抗原提呈、分泌細胞因子等功能于一身，是其它類型細胞所不能比擬的。正因為如此，單核細胞影響著免疫和炎癥反應的各個方面，同時在許多疾病的病原學及發(fā)病機制，特別是在RA發(fā)病中，起著重要的作用。最近，國際免疫學會聯(lián)

3、盟命名委員會將單核細胞分為CD14++CD16-、CD14++CD16+和CD14+CD16++三個亞群，新命名分類的這三群細胞在RA體內(nèi)的分布情況以及活化的血小板與單核細胞的黏附、聚集對單核細胞亞群的分化是否存在影響尚不十分清楚。因此，本課題測定了RA患者外周血血小板的活化及其與單核細胞的聚集情況，單核細胞亞群的比例和分布以及血小板對單核細胞活化和表型調(diào)控的作用。深入研究血小板在風濕免疫性疾病發(fā)病中的作用，探索該類疾病早期診斷及預后的

4、新指標，為臨床治療提供理論依據(jù)和治療靶點。
　　方法:
　　1.類風濕關(guān)節(jié)炎患者血小板的活化以及CD147的表達
　　收集本院住院RA患者（均符合美國風濕病學會1987年RA分類診斷標準）外周靜脈抗凝血，將40例RA患者分為30例活動組及10例非活動組，另設10例健康對照分別以Percp標記的抗CD61單克隆抗體，F(xiàn)ITC標記的抗PAC-1、抗 CD147單克隆抗體，PE標記的抗 CD40L、CD62P單克隆抗體，采用

5、流式細胞技術(shù)檢測RA患者及健康人的血小板表面 CD61設門、PAC-1、CD62P、CD40L和CD147表達的陽性率，分析類風濕關(guān)節(jié)炎患者血小板表面PAC-1、CD62P、CD40L和CD147的表達陽性率與炎癥活動指標的相關(guān)性。
　　2. RA外周血中單核細胞亞群的比例、CD147分子和胞內(nèi)因子的表達
　　采用PE標記的抗CD14抗體、PE-cy5標記的CD16抗體、APC標記的CCR2抗體染色，以流式細胞術(shù)檢測 RA患

6、者外周血單核細胞亞群分布的比例，觀察單核細胞（Mon）3個亞群：CD14+CD16-CCR2+(Mon1)，CD14+CD16+CCR2+(Mon2)和CD14+CD16+CCR2-(Mon3)的比例以、膜表面CD147分子的表達和各個亞群細胞內(nèi)TNF-a和IL-6的表達。
　　3.血小板與單核細胞在RA外周血中的聚集情況
　　采用四種流式表面抗體PE標記的抗CD14抗體、PE-cy5標記的抗CD16抗體、APC標記的抗CC

7、R2抗體，F(xiàn)ITC標記的抗CD42a抗體對外周血進行染色，采用流式細胞術(shù)檢測RA患者外周血血小板與單核細胞的聚集（MPA：CD14+CD42a+）；采用流式細胞術(shù)檢測 RA患者血小板與單核細胞三個亞群的聚集（CD14+CD16-CCR2+CD42a+，CD14+CD16+CCR2+CD42+和CD14+CD16+CCR2- CD42a+）。
　　4.活化血小板對單核細胞亞群的作用
　　分離健康人外周血單核細胞以及 RA患者的

8、血小板進行分組共培養(yǎng)。采用流式細胞術(shù)表面及胞內(nèi)因子染色以及明膠酶譜法觀察活化血小板對單核細胞亞群的比例、增殖、胞內(nèi)促炎因子的分泌變化和MMP的表達；其次，通過檢測單核細胞不同亞群Ikkβ的表達以及使用CD147mAb、Ikk抑制劑阻斷血小板與單核細胞的作用觀察 CD147是否參與其中，同時血小板與單核細胞間的相互作用是否可以通過阻斷CD147對NF-κB信號通路的活化實現(xiàn)。
　　分離健康人外周血中的單個核細胞（PBMC）并用流式細

9、胞儀分選 CD14+的單核細胞。分離活動期RA患者外周血中的洗滌血小板。將分選后的單核細胞與RA患者的血小板進行分組共培養(yǎng)48小時后，以FITC標記的抗TNF-α、IL-6、Ikkβ抗體采用細胞膜表面標志及胞內(nèi)因子四重染色，流式細胞術(shù)檢測活化血小板對單核細胞亞群的比例、增殖和胞內(nèi)促炎細胞因子產(chǎn)生的作用，并采用明膠酶譜法觀察促進MMP的產(chǎn)生的作用。其次，使用抗CD147mAb、Ikk抑制劑進行阻斷試驗，采用流式細胞術(shù)檢測抗體阻斷后活化血小

10、板對單核細胞亞群的作用。進而明確CD147是否通過NF-κB信號通路參與上述活化血小板對單核細胞的作用。
　　結(jié)果：
　　1．類風濕關(guān)節(jié)炎患者血小板的活化以及CD147的表達
　　RA患者外周血血小板表面的標記（PAC-1，CD62P，CD40L和CD147）均較健康對照組明顯升高(Active or Inactive RA,P<0.01)，特別是在活動的RA患者組升高尤為明顯(Active RA vs HD,P<0.

11、01)，具有統(tǒng)計學差異。而這四種標記中又以CD147的表達水平增高最為顯著。用DAS-28評分衡量患者病情活動度，并與血小板表面活化標記（PAC-1，CD62P和CD147）進行相關(guān)性分析顯示呈顯著的正相關(guān)（r=0.497，r=0.57和r=0.63；P<0.01）。研究揭示，RA患者外周血中血小板處于高度活化狀態(tài)并高表達CD147分子，而且血小板活化和表達CD147的程度與疾病的活動度呈正相關(guān)。2．RA單核細胞亞群的比例、CD147分

12、子和胞內(nèi)因子的表達
　　RA患者外周血中Mon1亞群的比例較對照組降低（Active or Inactive RA vs HD，P<0.01），Mon2、Mon3亞群的比例較對照組均增高（Active or Inactive RA vs HD，P<0.05），其中尤以Mon2亞群升高的比例最為顯著(Active or Inactive RA vs HD，P<0.001)，而且在這三組對象中，活動的RA患者外周血Mon2亞群的比例較

13、對照組升高最為明顯（Active RA vs HD,P<0.001）。CD147在RA患者外周血單核細胞的三個亞群中均高表達（Active or Inactive RA vs HD,P<0.01），且以活動RA患者外周血Mon2亞群上CD147表達水平升高最為顯著（Active RA vs HD,P<0.001），同時該群細胞表達TNF-a和IL-6的水平也顯著升高（Active RA vs HD,P<0.001）。研究揭示，RA患者外

14、周血中單核細胞Mon2亞群比例的升高，CD147和細胞因子的高表達提示Mon2亞群具有較強的遷移、侵襲和促炎功能，由此可能在RA的發(fā)病過程中占據(jù)主導作用。
　　3．RA外周血中血小板與單核細胞的聚集（MPA）情況
　　MPA的水平在RA患者外周血中顯著升高（Active or Inactive RA vs HD，P<0.001），尤其是在活動RA組尤為明顯（Active RA vs HD,P<0.001）。進一步分析血小板與

15、單核細胞各個亞群的聚集發(fā)現(xiàn)，MPA水平在各個亞群都有所升高（Active or Inactive RA vs HD,P<0.001），特別是在活動期的RA患者組（Active RA vs HD，P<0.001），這其中又以Mon2群升高更為明顯?；顒悠赗A患者外周血中MPA水平與血小板上CD147的表達、Mon2亞群比例和Mon2亞群上CD147的表達進行相關(guān)性分析顯示呈顯著的正相關(guān)（r=0.61，r=0.66和r=0.77；），而在與

16、健康對照以及其他兩個亞群的相關(guān)性分析中并沒有統(tǒng)計學差異。研究表明，RA患者外周血中血小板與單核細胞的聚集增多主要是源自于血小板與單核細胞 Mon2亞群的聚集增加所致，并由此推測 RA患者外周血血小板上高表達的 CD147和Mon2亞群上高表達的CD147通過同型配體之間的相互作用在二者的聚集以及血小板對單核細胞亞群的作用中發(fā)揮重要的作用。
　　4．活化血小板對單核細胞亞群的作用
　　RA患者的血小板與單核細胞接觸共培養(yǎng)組Mo

17、n2亞群的比例明顯高于其他分組（P<0.01）。其次，CD147單抗阻斷組和非接觸共培養(yǎng)組Mon2亞群的比例較共培養(yǎng)組低（P<0.01）。此外，我們用BrdU流式試劑盒檢測了以上分組中單核細胞亞群BrdU的水平，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)接觸共培養(yǎng)組Mon2亞群的BrdU表達較其他組升高（P<0.05），說明這群細胞的增殖力旺盛。同樣的分組，我們檢測單核細胞各個亞群胞內(nèi)因子的表達，發(fā)現(xiàn)RA的血小板與單核細胞接觸共培養(yǎng)組胞內(nèi)IL-6和TNF-α的水平明

18、顯高于其他分組（P<0.01）。而且，胞內(nèi)因子IL-6和TNF-α的水平主要在Mon2群細胞表達升高明顯，在另外兩群中表達較低尤其是對 Mon1群細胞的表達幾乎無影響。通此外，通過檢測胞內(nèi)Ikkβ的表達水平發(fā)現(xiàn)接觸共培養(yǎng)組Mon2亞群的表達水平最高（P<0.01），明膠酶譜實驗也得到了類似的結(jié)果。應用CD147mAb和Ikk阻斷二者的相互作用發(fā)現(xiàn)單核細胞 Mon2亞群的比例、增殖能力、與血小板的聚集、胞內(nèi)因子的分泌以及 MMP-9的表達

19、均呈現(xiàn)不同程度的抑制作用。通過我們的研究結(jié)果說明CD147分子參與血小板促進單核細胞亞群的分化、增殖、侵襲以及發(fā)揮促炎作用，并且該作用是通過活化NF-κB信號通路實現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　本課題研究結(jié)果顯示RA患者外周血的血小板呈活化狀態(tài)，可高表達CD147分子，并且與疾病活動度呈正相關(guān)性；RA患者外周血中的三個單核細胞亞群以Mon2亞群比例升高為主，且高表達CD147分子；血小板三個單核細胞亞群中血小板與單核細胞形成的聚集

20、物水平在RA中顯著增多，且該聚集水平與血小板的活化、Mon2亞群的比例以及高表達的 CD147均呈正相關(guān)關(guān)系；RA患者外周血的血小板與單核細胞通過直接接觸作用影響單核細胞亞群，尤其是 Mon2亞群的分布比例、增殖，胞內(nèi)因子的分泌和MMP的表達，并且阻斷CD147分子對上述效應均有顯著抑制作用，說明活化血小板上高表達的CD147對單核細胞亞群尤其是發(fā)揮促炎作用的Mon2群的分化中發(fā)揮了重要作用，其次，通過對細胞內(nèi)Ikkβ表達的分析以及阻斷