PNPLA3基因I148M多態(tài)性在體外培養(yǎng)肝細(xì)胞中的作用研究.pdf

1、目的:探討PNPLA3基因I148M多態(tài)性在體外培養(yǎng)肝細(xì)胞中的作用機(jī)制。
　　 方法:對(duì)經(jīng)典的兩步灌流法進(jìn)行簡(jiǎn)化，經(jīng)下腔靜脈灌流，脈沖式灌注;對(duì)肝細(xì)胞分離液進(jìn)行低速離心純化;預(yù)先用鼠尾膠原鋪備培養(yǎng)瓶;臺(tái)盤(pán)藍(lán)染色鑒定細(xì)胞存活率;倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。PCR技術(shù)得到PNPLA3基因野生型和I148M突變型的完整編碼序列，將序列克隆到載體質(zhì)粒pEGH中，構(gòu)建載體質(zhì)粒pEGH-PNPLA3和pEGH-PNPLA3 I148M;載體質(zhì)粒

2、pEGH-PNPLA3或pEGH-PNPLA3 I148M與慢病毒包裝質(zhì)粒pRsv-REV、pMD(l)g-pRR和pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，得到攜帶PNPLA3基因野生型和I148M突變型完整編碼序列的慢病毒;兩種慢病毒各自感染Huh-7細(xì)胞;Western blot檢測(cè)Huh-7細(xì)胞中PNPLA3蛋白野生型和突變型的過(guò)表達(dá)情況。穩(wěn)定過(guò)表達(dá)目的基因的細(xì)胞長(zhǎng)至90％融合度時(shí)，消化裂解細(xì)胞，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞裂解液內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)

3、產(chǎn)物。穩(wěn)定過(guò)表達(dá)目的基因的細(xì)胞長(zhǎng)至70％融合度時(shí)，加入終濃度為50μmol/L的辛伐他汀，24小時(shí)后，消化裂解細(xì)胞，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞裂解液內(nèi)脂質(zhì)水平。穩(wěn)定過(guò)表達(dá)目的基因的細(xì)胞長(zhǎng)至90％融合度時(shí)，消化細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　 結(jié)果:改進(jìn)后的分離方法得到了足夠數(shù)量的肝細(xì)胞;臺(tái)盤(pán)藍(lán)染色示細(xì)胞活率大于90％;細(xì)胞形態(tài)與活力可穩(wěn)定保持1周。成功構(gòu)建慢病毒載體;熒光顯微鏡觀察顯示慢病毒有效感染Huh-7，經(jīng)過(guò)篩選，細(xì)胞感

4、染有效率超過(guò)95％; Western blot證實(shí)PNPLA3蛋白野生型和突變型成功過(guò)表達(dá)。與空病毒組相比，過(guò)表達(dá)PNPLA3基因的細(xì)胞內(nèi)甘油三酯、總膽固醇、脂蛋白含量明顯升高，轉(zhuǎn)氨酶水平也明顯升高，過(guò)表達(dá)PNPLA3基因I148M突變型的細(xì)胞內(nèi)以上指標(biāo)升高更明顯。經(jīng)過(guò)辛伐他汀處理24小時(shí)以后，空病毒組與過(guò)表達(dá)PNPLA3基因野生型的Huh-7細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯和總膽固醇的含量有顯著下降，而過(guò)表達(dá)PNPLA3基因I148M突變型的Huh-

5、7細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯和總膽固醇含量不降反升。在Huh-7細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)PNPLA3基因I148M突變型，改變了細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程，使得異倍體（S期）和4倍體（G2/M期）增多，而二倍體（G0/G1期）減少。
　　 結(jié)論:成功建立了一種簡(jiǎn)單的小鼠原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法。成功構(gòu)建了PNPLA3基因慢病毒載體及Huh-7過(guò)表達(dá)PNPLA3細(xì)胞系。成功證實(shí)了PNPLA3基因I148M多態(tài)性可以獨(dú)立引起體外培養(yǎng)肝細(xì)胞脂肪變性，降低體外培養(yǎng)