PNPLA3基因I148M多態(tài)性在非酒精性脂肪性肝纖維化中的機(jī)制研究.pdf

1、目的:在動(dòng)物和細(xì)胞水平上探究PNPLA3 I148M基因多態(tài)性對Hedgehog(Hh)信號(hào)通路表達(dá)的影響，從而揭示PNPLA3 I148M基因多態(tài)性在非酒精性脂肪性肝纖維化中作用機(jī)制。
　　方法:采用顯微注射法構(gòu)建了野生型純合子(pNpLA3+/+)、雜合子(PNPLA3148M/+)、突變型純合子(PNPLA3148M/M)三種轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在相同環(huán)境下，采用正常飲食、飲水飼養(yǎng)16周后，將小鼠在乙醚麻醉后迅速解剖，從心臟采取

2、血液標(biāo)本，檢測血清中的TG、TC、ALT、AST的水平，獲取小鼠新鮮的肝臟組織標(biāo)本，采用熒光定量PCR的檢測Hh信號(hào)通路基因以及與細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，采用western blot在蛋白水平上對上述基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，運(yùn)用雙酶切的方法合成PNPLA3 I148M野生型及突變型的基因序列和慢病毒載體序列，將目的基因序列和載體序列進(jìn)行連接，合成攜帶目的基因的載體質(zhì)粒并對其純化擴(kuò)增及轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，從而獲得高滴度攜帶P

3、NPLA3不同基因型的慢病毒;采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，利用嘌呤霉素對轉(zhuǎn)染的HSC-T6細(xì)胞株進(jìn)行篩選，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)PNPLA3 I148M野生型和突變型基因細(xì)胞系，在此基礎(chǔ)上，分別檢測過表達(dá)PNPLA3 I148M野生型和突變型基因的HSC-T6細(xì)胞內(nèi)Hh信號(hào)通路及與細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，并采用Western blot進(jìn)行蛋白水平上的驗(yàn)證。定量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”進(jìn)行表述，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對定量資料進(jìn)

4、行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為P＜0.05。
　　結(jié)果:(1)與PNPLA3+/+小鼠相比，PNPLA3148M/M小鼠血清中ALT水平高于PNPLA3+/+小鼠，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)與PNPLA3+/+小鼠相比，PNPLA3148M/+和PNPLA3148M/M小鼠肝臟組織內(nèi)shh、patched、smo、gli-1等基因的表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)與PNPLA3+/+小鼠相比，我們發(fā)現(xiàn)PNPLA3148M/+和

5、PNPLA3148M/M小鼠肝臟組織內(nèi)bcl-2，PDGF和TGFβ1等基因的表達(dá)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)成功組裝了攜帶PNPLA3 I148M野生型和突變型基因的慢病毒，并成功感染了HSC-T6細(xì)胞，采用倒置熒光顯微鏡觀察，綠色熒光陽性率達(dá)到85％，采用嘌呤霉素篩選后，陽性率達(dá)到95％以上。采用Western blot驗(yàn)證野生型組和突變型組細(xì)胞內(nèi)PNPLA3蛋白較空載體對照組細(xì)胞表達(dá)增加，證實(shí)過表達(dá)PNPLA3 I148M

6、野生型和突變型基因的HSC-T6細(xì)胞株構(gòu)建成功。(5)PNPLA3 I148M突變基因過表達(dá)的HSC-T6細(xì)胞系內(nèi)shh、patched、smo、gli-1等基因的相對表達(dá)量明顯高于野生型細(xì)胞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(6)與PNPLA3 I148M野生型細(xì)胞相比，突變型細(xì)胞內(nèi)bcl-2，PDGF和TGFβ1表達(dá)明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:PNPLA3 I148M基因突變可能通過促進(jìn)Hh信號(hào)通路的激活，引起肝星狀細(xì)胞的