uPA-PAI-1在非酒精性脂肪性肝纖維化進展中作用及機制的研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝臟損傷。隨著人們膳食結構及生活方式的改變，全球NAFLD患病率呈現(xiàn)上升趨勢，其疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化、肝硬化、肝細胞癌。非酒精性脂肪性肝纖維化是疾病進展至肝硬化、肝癌和終末期肝病必經(jīng)的病理階段，肝纖維化病變能否控制或逆轉在很大程度上影響患者的預后。目前臨床缺乏高效、無明

2、顯毒副作用的抗肝纖維化西藥，中藥因其多組分、多途徑、多靶點抗肝纖維化作用而日益引起學者關注。已有研究表明，丹參、桃仁、絞股蘭等中藥均有一定的抗肝纖維作用，由以上三味中藥為主組成的扶正化瘀復方具有良好的抗慢性乙型肝炎肝纖維化的作用，但該中藥復方對非酒精性脂肪性肝纖維化的作用及作用機制尚不明確。uPA/PAI-1是調節(jié)細胞外基質降解的主要酶系，它們的表達失衡直接影響細胞外基質沉積，進而影響肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。本研究以蛋氨酸-膽堿缺乏(me

3、thionine andcholine deficient，MCD)飲食建立小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化模型，扶正化瘀復方或聯(lián)合血紅素氧化酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)激動劑、抑制劑進行干預實驗，旨在探明uPA/PAI-1在非酒精性脂肪性肝纖維化進展中的作用及扶正化瘀復方和/或HO-1激動劑對uPA/PAI-1表達的影響及作用機制。
　　方法：選用清潔級8周齡健康雄性C57BL/6J小鼠(中國醫(yī)學科學院實驗動物

4、研究所)，所有小鼠普通飼料喂養(yǎng)1周后隨機分為7組，以MCD飲食喂養(yǎng)8周建立非酒精性脂肪性肝纖維化模型，同時分別應用扶正化瘀復方、HO-1激動劑血晶素、抑制劑鋅原卟啉、扶正化瘀復方聯(lián)合HO-1激動劑或抑制劑進行干預實驗，以蛋氨酸-膽堿充足飲食設立對照組。喂養(yǎng)8周造模結束后，深度麻醉下取血，4℃離心分離血清，留取部分肝組織以4％中性甲醛固定，備做病理切片，其余肝組織用液氮快速冷凍后置于-80℃冰箱保存，備提取蛋白、mRNA。
　　1.

5、觀察實驗小鼠一般情況：處死小鼠前觀察其精神狀態(tài)、毛發(fā)，并稱量體重及肝濕重，計算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100％)。
　　2.血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)采用日本Olympus AU5400全自動生化分析儀酶法測定。
　　3.肝組織切片采用蘇木精-伊紅(haematoxylin and eosi

6、n，HE)染色觀察肝細胞脂肪變、炎癥程度；Masson染色觀察肝纖維化程度。
　　4.肝組織纖維化相關基因檢測：采用逆轉錄聚合酶鏈反應(reversetranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)、Western blot及免疫組織化學檢測肝組織HO-1、轉化生長因子β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)、尿激酶型纖溶酶原激活物(uro

7、kinase type plasminogen activator，uPA)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、基質金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA及蛋白的表達。
　　5.實驗結果

8、采用SPSS13.0單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用Student-Newman-Keuls分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.實驗動物一般情況：對照組小鼠活潑、毛發(fā)有光澤，體重、肝濕重隨造模時間延長逐漸增加。各干預組小鼠精神差，體重、肝濕重均顯著低于對照組，尤以HO-1抑制劑組下降最為明顯(P值均<0.05)，但各干預組小鼠體重及肝濕重之間無顯著統(tǒng)計學差異。各組實驗小鼠肝指數(shù)亦無顯著統(tǒng)計學

9、差異(P>0.05)。
　　2.血清ALT、AST水平：血清ALT和AST水平依次為：對照組<扶正化瘀復方聯(lián)合HO-1激動劑組<扶正化瘀復方組　　3.肝組織病理學變化：對照組小鼠肝小葉結構正常，肝板走行整齊；模型組小鼠肝組織出現(xiàn)中至重度肝細胞脂肪變性，呈現(xiàn)大泡性為主的脂肪變，以腺泡3帶為著，伴有點、灶狀

10、肝細胞壞死、炎細胞浸潤、輕度匯管區(qū)纖維組織增生及竇周纖維化；HO-1激動劑組、扶正化瘀復方組及扶正化瘀復方聯(lián)合HO-1激動劑組肝細胞脂肪變及炎癥活動度較模型組均明顯減輕，尤以扶正化瘀復方聯(lián)合HO-1激動劑組改善顯著；HO-1抑制劑組肝組織炎癥及纖維化程度較模型組加重，扶正化瘀復方聯(lián)合HO-1抑制劑組肝細胞脂肪變及炎癥程度較HO-1抑制劑組減輕。
　　4.肝組織HO-1、TGF-β1、uPA、PAI-1、MMP-9和TIMP-1 m

11、RNA及蛋白表達情況：伴隨血清ALT、AST水平升高，模型組肝組織纖維化相關基因TGF-β1、PAI-1、uPA、MMP-9、TIMP-1及HO-1 mRNA表達較對照組顯著升高。扶正化瘀復方組HO-1、TGF-β1、PAI-1、TIMP-1 mRNA及蛋白表達量較模型組顯著降低(P<0.05)，而uPA、MMP-9表達量呈相反趨勢(P<0.05)；扶正化瘀復方聯(lián)合HO-1激動劑組伴隨HO-1 mRNA及蛋白表達上調，PAI-1、TGF

12、-β1、TIMP-1表達進一步減弱(P<0.05)，uPA、MMP-9表達進一步增強(P<0.05)；與扶正化瘀復方組比較，扶正化瘀復方聯(lián)合HO-1抑制劑組uPA、MMP-9表達下調，TGF-β1、PAI-1、TIMP-1表達升高(P<0.05)。各相關基因蛋白表達趨勢與mRNA一致。
　　結論：
　　1.在MCD飲食誘導的非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠模型中，TGF-β1、PAI-1、uPA、MMP-9及TIMP-1等纖維化相