吡格列酮調(diào)控TLR4-NF-kB信號(hào)通路阻止非酒精性脂肪性肝纖維化進(jìn)展的研究.pdf

1、目的:隨著人們生活方式和的膳食結(jié)構(gòu)的改變,非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)在世界范圍內(nèi)已成為最常見的慢性肝病之一,NAFLD疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)/肝纖維化、NASH相關(guān)肝硬化及肝細(xì)胞癌。非酒精性脂肪性肝纖維化是NAFLD進(jìn)展過程中的重要病理階段,約有20％-40％NASH患者進(jìn)展為肝纖

2、維化或肝硬化。因此,尋求防治非酒精性脂肪性肝炎/肝纖維化的有效策略為目前研究的熱點(diǎn)。機(jī)體免疫參與多種慢性肝臟炎癥及肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,Toll樣受體(tolllikereceptor,TLR)是天然免疫系統(tǒng)中識(shí)別病原微生物的主要受體,尤以TLR4的作用最受關(guān)注,TLR4活化后通過激活核因子κB抑制物激酶-β(inhibitorofnuclearfactor-κBkinase-β,IKK-β)/核因子(nuclearfactor-κB,N

3、F-κB)促進(jìn)炎癥因子和纖維化因子的分泌,導(dǎo)致肝臟炎癥及纖維化。我們前期研究表明,過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferators-activatedreceptors,PPARγ)激動(dòng)劑能夠有效延緩非酒精性脂肪性肝纖維化的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)以蛋氨酸-膽堿缺乏(methionineandcholinedeficient,MCD)飲食建立小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化模型,以PPAR激動(dòng)劑和抑制劑進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn),旨在探明靶

4、向調(diào)控PPARγ表達(dá)對(duì)非酒精性脂肪性肝纖維化肝組織TLR4/NF-(k)B信號(hào)通路的作用及其機(jī)制,為臨床有效防治非酒精性脂肪性肝纖維化提供新的策略及科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:選用健康雄性C75BL/6J小鼠,采用膽堿-蛋氨酸缺乏飲食(MCD)8周建立小鼠非酒精性脂肪性肝纖維化模型(MCD組),分別以PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮(MCD+PIO組)及抑制劑GW9662(MCD+GW組)進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn),并以膽堿-蛋氨酸充足飲食設(shè)立對(duì)照組(C

5、ontrol)。
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況觀察:實(shí)驗(yàn)過程中觀察小鼠一般情況,如進(jìn)食情況、活動(dòng)力、毛發(fā)及體重變化等,造模結(jié)束時(shí)稱取小鼠體重及肝濕重,計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重/體重×100％)。
　　 2、血清生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase,ALT)和門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase,AST),采用全自動(dòng)生化分析儀、酶法測(cè)定。
　　

6、3、肝組織病理學(xué)觀察:HE、Masson染色觀察肝臟脂肪變、炎癥活動(dòng)及纖維化程度。
　　 4、肝組織相關(guān)基因檢測(cè):采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Westernblot檢測(cè)PPARγ、TLR4、IKK-β和NF-κBmRNA及蛋白的表達(dá)。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,多組間比較采用單因素方差分析,各組間比較采用LSD-t,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　

7、 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況:Control組小鼠進(jìn)食正常、活潑、毛發(fā)有光澤;MCD組及MCD+GW組小鼠進(jìn)食逐漸減少,精神萎靡,少動(dòng),毛發(fā)紊亂,無光澤,體重及肝指數(shù)較對(duì)照組明顯降低;MCD+PIO組小鼠一般情況較MCD組小鼠明顯改善。
　　 2、實(shí)驗(yàn)小鼠血清生化學(xué)改變:MCD組小鼠ALT及AST較Control組顯著升高(431.12±35.17U/L比32.97±3.31U/L及423.85±28.02U/L比33.82±3.68

8、U/L,P值＜0.05);MCD+PIO組ALT及AST較MCD組顯著降低(321.98±39.69U/L比431.12±35.17U/L及330.30±43.99U/L比423.85±28.02U/L,P值均＜0.05),而MCD+GW組ALT及AST水平高于MCD組(705.55±28.90U/L比431.12±35.17U/L及663.57±29.59U/L比423.85±28.02U/L,P均值＜0.05)。
　　 3、

9、肝組織病理學(xué)改變:Control組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝板排列整齊,MCD組肝細(xì)胞呈中至重度脂肪變,以腺泡Ⅲ帶為著,伴點(diǎn)灶狀肝細(xì)胞壞死及炎細(xì)胞浸潤,匯管區(qū)纖維組織增生及竇周纖維化(NAS評(píng)分7～8S2～3)。MCD+PIO組小鼠肝脂肪變、炎癥及纖維化程度較MCD組明顯減輕(NAS評(píng)分5～6S1～2),而MCD+GW組小鼠肝組織損傷程度較MCD組加重(NAS評(píng)分7～8S3～4)
　　 4、肝組織PPARγ、TLR4、IKK-β及N

10、F-κBmRNA表達(dá)變化:MCD組PPARγmRNA較Control組明顯降低(P＜0.05),TLR4、IKK-β及NF-κBmRNA顯著升高,mRNA表達(dá)量(拷貝)分別為:0.54±0.06比0.96±0.05、4.60±0.02比1.01±0.06、3.59±0.54比1.01±0.03及4.62±0.28比0.99±0.01(P值均0.05);與MCD組相比,MCD+PIO組隨著PPARγmRNA表達(dá)上調(diào),TLR4、IKK-β及

11、NF-κBmRNA表達(dá)下調(diào),mRNA表達(dá)量(拷貝)分別為:0.74±0.02、2.42±0.10、1.34±0.51及2.42±0.50(P值均＜0.05);而MCD+GW組PPARγmRNA表達(dá)明顯受抑制,TLR4、IKK-β及NF-κBmRNA表達(dá)則顯著增強(qiáng),mRNA表達(dá)量(拷貝)分別為:0.23±0.02、7.17±0.16、6.61±0.27及7.66±0.35,與MCD組及MCD+PIO組相比P值均＜0.05。
　　

12、5、肝組織PPARγ、TLR4、mK-β及NF-κB蛋白表達(dá)變化:MCD組PPARγ蛋白較Control組明顯降低,TLR4、IKK-β及NF-κBmRNA及蛋白顯著升高,蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:0.81±0.04比1.58±0.09、1.17±0.04比0.44±0.02、1.06±0.07比0.43±0.05及1.04±0.02比0.44±0.05(P值均＜0.05);與MCD相比,MCD+PIO組隨著PPARγ蛋白表達(dá)上調(diào),TLR4

13、、IKK-β及NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào),蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:1.07±0.09、0.76±0.01、0.71±0.08及0.70±0.05(P值均＜0.05);而MCD+GW組PPARγ蛋白表達(dá)明顯受抑制,TLR4、IKK-β及NF-κB蛋白表達(dá)則顯著增強(qiáng),蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為:0.53±0.10、1.64±0.03、1.76±0.26及1.84±0.10,與MCD組及MCD+PIO組相比P值均＜0.05。
　　 結(jié)論: