Nrf2及齊墩果酸在酒精性肝纖維化中的作用機(jī)制研究.pdf

1、核因子相關(guān)因子-2(Nrf2)是肝臟細(xì)胞防御氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子，通過介導(dǎo)一系列抗氧化酶和2相解毒酶的表達(dá)，降低各種藥物、毒素、化學(xué)致癌物等有害物質(zhì)肝毒性。酒精是引起氧化應(yīng)激常見損害因素之一，酒精性肝纖維化是臨床常見病，部分病人戒酒后并不能完全阻止肝纖維化進(jìn)展。齊墩果酸是一種傳統(tǒng)護(hù)肝藥物，主要成分五環(huán)三萜類化合物，可從多種中藥中提取，其保肝作用具體分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。國外有研究證明人工合成三萜類化合物對Nrf2-keap通路有顯著

2、激活作用。本研究旨在觀察Nrf2在小鼠酒精性肝纖維化(ALF)中表達(dá)情況，探討齊墩果酸抗纖維化作用分子生物學(xué)機(jī)制，為ALF的預(yù)防和治療提供新的思路。
　　 目的：⑴觀察通過酒精灌胃的方法建立昆明種小鼠肝纖維化模型情況。并檢測肝纖維化小鼠血清ALT、AST及TBIL水平及總結(jié)肝組織病理改變特點(diǎn)。⑵觀察核因子相關(guān)因子-2(NF-E2-related Factor2，Nrf2)在小鼠酒精性肝纖維化(alcoholic liver fi

3、brosis，ALF)表達(dá)情況。⑶觀察齊墩果酸對正常小鼠及飲酒小鼠肝細(xì)胞Nrf2表達(dá)情況。⑷觀察齊墩果酸預(yù)處理能否減輕肝細(xì)胞炎癥侵潤、改善肝細(xì)胞損傷，預(yù)防或減緩纖維化進(jìn)程，探討抗纖維化分子生物學(xué)機(jī)制。⑸觀察齊墩果酸對正常小鼠及飲酒小鼠肝細(xì)胞增殖及凋亡影響。⑹研究酒精對小鼠單核巨噬細(xì)胞激活情況，為下一步探索其在肝纖維化進(jìn)程中作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：30只昆明種健康雌性小鼠，正常飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為4組：模型組(B組

4、)10只，通過50％酒精灌胃(gastric infusing，ig)建立小鼠酒精性肝纖維化動物模型；治療組(C組)10只，預(yù)先給予齊墩果酸灌胃進(jìn)行干預(yù)，酒精灌胃方法同模型組；對照組：A1組5只，只應(yīng)用生理鹽水灌胃作為對照。A2組5只，只應(yīng)用齊墩果酸灌胃作為對照。四組均自由飲水和進(jìn)食分籠喂養(yǎng)于20-25℃明暗各12小時的動物中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，分別于12周末以10％的水合氯醛(3-5ml/kg)腹腔注射麻醉處死(處死前隔夜禁食)。處死小鼠2小

5、時前，腹腔注射250mg/kg BrdU(標(biāo)記增殖肝細(xì)胞)。采血途徑為心臟穿刺取血，離心后取血清，于-20℃保存。迅速收獲肝臟標(biāo)本，3/4部分用10％的甲醛溶液固定，制作石蠟切片，1/4部分液氮快速冰凍后儲存于-80℃冰柜中，用于制備RNA懸液等。標(biāo)本分批作如下檢測：①血清標(biāo)本送檢臨床生化室，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血清酶學(xué)指標(biāo)ALT、AST及TBIL水平；②肝臟石蠟切片常規(guī)HE染色觀察各組小鼠肝臟組織病理學(xué)改變(炎細(xì)胞浸潤、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞

6、壞死分級情況參照Thompson[37]慢性肝損害評分標(biāo)準(zhǔn))；MT染色評價纖維化情況，并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)量化分析；③免疫組化及免疫熒光方法檢測Nrf2在對照組及模型組中表達(dá)情況及齊墩果酸預(yù)處理對酒精性肝纖維化小鼠Nrf2的表達(dá)影響；檢測各組小鼠細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN的表達(dá)；應(yīng)用ER-MP23抗體(抗巨噬細(xì)胞凝集素特異性單克隆抗體)標(biāo)記免疫熒光方法檢測巨噬細(xì)胞激活及侵潤情況。應(yīng)用BrdU標(biāo)記免疫組化方法檢測各組小鼠肝細(xì)胞增殖情況。應(yīng)用TUNE

7、L(原位末端標(biāo)記法)染色法檢測原位肝細(xì)胞凋亡情況。④肝臟冰凍標(biāo)本送檢分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，定量RT-PCR法檢測各組小鼠纖維化相關(guān)因子CollagenⅠα、TGF-β1、α-SMA mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：⑴A1及A2對照組小鼠ALT、AST及TBIL水平無顯著性差別(p>0.05)。模型組小鼠ALT、AST及TBIL水平較對照組均有顯著升高(p<0.05)。齊墩果酸治療組小鼠ALT、AST及TBIL水平較模型組有顯著下降

8、(p<0.05)。⑵HE染色結(jié)果：對照組A1及A2組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)和匯管區(qū)、細(xì)胞形態(tài)均正常，未見明顯炎細(xì)胞侵潤。模型組小鼠肝細(xì)胞變性嚴(yán)重，見散在的多發(fā)灶狀甚至結(jié)節(jié)樣壞死，小葉中央?yún)^(qū)及匯管區(qū)見大量炎癥細(xì)胞浸潤，以單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主，并有一些中性粒細(xì)胞浸潤。治療組情況較模型組炎細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞壞死情況相對較輕。治療組與模型組炎細(xì)胞浸潤評分情況分別為1.90±0.74 vs2.70±0.95(p<0.05)：肝細(xì)胞損傷比較評分情況分別為1

9、.80±0.79 vs2.40±0.51(p<0.05)。 MT染色結(jié)果：對照組A1及A2組小鼠肝臟組織僅在血管周圍見極輕微纖維化(藍(lán)色部分)，且兩個對照組間無顯著差別。模型組小鼠肝組織匯管區(qū)及中央靜脈周圍見較多纖維組織分割，較寬，且相互連接、融合。治療組纖維化范圍較模型組明顯減小，且纖維分隔多纖細(xì)。形態(tài)學(xué)測量分析分別為1.86±1.23％VS3.55±1.37％(p<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。⑶Nrf2表達(dá)情況：A1及A2對照組小

10、鼠，Nrf2在極少數(shù)肝細(xì)胞胞漿中表達(dá)，且兩個對照組間無顯著差別；模型組小鼠肝細(xì)胞胞漿Nrf2表達(dá)明顯增強(qiáng)；治療組小鼠Nrf2在肝細(xì)胞胞漿中表達(dá)顯著強(qiáng)于模型組小鼠，分別為92.31±15.45VS69.31±12.18(p<0.01)。FN表達(dá)情況：A1及A2對照組小鼠極少量FN表達(dá)，兩個對照組間無顯著差別。模型組小鼠FN表達(dá)明顯增強(qiáng)。治療組小鼠FN的表達(dá)與模型組相比明顯減弱，分別為2.32±1.13％VS5.17±2.05％(p<0.0

11、5)。巨噬細(xì)胞免疫熒光染色：A1及A2對照組小鼠肝臟見極少數(shù)ER-MP23陽性細(xì)胞，且兩個對照組間無顯著差別。模型組與治療組小鼠ER-MP23陽性細(xì)胞數(shù)分別為(178±35個/mm2VS113±29)個/mm2，p<0.05)，治療組巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。原位肝細(xì)胞凋亡情況：A1及A2對照組小鼠僅見極少數(shù)肝細(xì)胞凋亡，且兩個對照組間無顯著差別。模型組與治療組小鼠凋亡細(xì)胞數(shù)分別為(232±45個/mm2VS209±27)個

12、/mm2，p>0.05)，治療組小鼠肝細(xì)胞凋亡有所減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。肝細(xì)胞增殖分析：A1及A2對照組小鼠僅見極少數(shù)BrdU陽性肝細(xì)胞(1.09±1.03％VS1.15±1.24％，p>0.01)，且兩個對照組間無顯著差別。模型組與治療組小鼠BrdU陽性細(xì)胞數(shù)分別為(2.35±1.21％VS2.75±1.06％，p>0.05)，治療組肝細(xì)胞增殖率較模型組略高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。⑷四個組小鼠肝組織COL1α、TGF-β1及α-SM

13、AmRNA表達(dá)結(jié)果一致。A1及A2對照組小鼠肝臟組織幾乎未見COL1α、TGF-β1及α-SMAmRNA表達(dá)。模型組小鼠COL1α、TGF-β1及α-SMAmRNA表達(dá)水平明顯升高。齊墩果酸預(yù)處理組較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：①采用酒精灌胃方法12周可以成功建立小鼠ALF模型。該造模方法符合人類飲酒特點(diǎn)，簡便易行且成功率高，是一種有效的造模方法。②Nrf2在酒精性肝纖維化小鼠肝組織中表達(dá)增加，原因考慮肝細(xì)胞

14、對酒精引起氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)所致.齊墩果酸能增強(qiáng)飲酒小鼠肝臟Nrf2表達(dá)，但對正常小鼠肝臟Nrf2表達(dá)無影響。③齊墩果酸能顯著降低飲酒小鼠的血清ALT、AST、TBIL水平，減輕肝細(xì)胞的變性、壞死、炎細(xì)胞反應(yīng)以及肝小葉纖維化。齊墩果酸對正常對照組小鼠血清ALT、AST、TBIL水平及COL1α、α-SMA、TGF-β1 mRNA表達(dá)并無影響。齊墩果酸對正常小鼠肝臟組織病理學(xué)無影響。其保肝及抗纖維化分子生物學(xué)機(jī)制可能是通過增強(qiáng)酒精

15、損傷肝細(xì)胞Nrf2表達(dá)，誘導(dǎo)下游抗氧化基因表達(dá)，保護(hù)肝細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激，減少巨噬細(xì)胞激活及侵潤，降低TGF-β1 mRNA的表達(dá)，阻止星形細(xì)胞的激活，下調(diào)COL1α的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成與和蓄積而實(shí)現(xiàn)其抗纖維化作用的。④齊墩果酸對正常小鼠肝細(xì)胞增殖與凋亡無影響。但能在一定程度促進(jìn)飲酒小鼠肝細(xì)胞增殖，并降低肝細(xì)胞凋亡率，但與模型組小鼠相比無顯著差別。肝細(xì)胞增殖與凋亡有多重機(jī)制參與，齊墩果酸可能僅對其中某方面機(jī)制有決定作用，故無法