miR-21-4T1細(xì)胞的構(gòu)建及其exosome功能的初步研究.pdf

1、目的:microRNA-21(miR-21)是一種在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)的microRNA，包括乳腺癌，它參與并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展。細(xì)胞中的microRNA可以分泌到exosome中去。Exosome是一種細(xì)胞分泌的膜性納米小泡。腫瘤分泌的exosome可以通過自分泌方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，通過旁分泌或者是內(nèi)分泌方式抑制免疫監(jiān)視、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，為其生長和進(jìn)展提供一個(gè)有利的環(huán)境。為了進(jìn)一步探討miR-21是否會通過釋放的exosom

2、e影響腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了高表達(dá)miR-21的4T1細(xì)胞株，初步探究其分泌的exosome對腫瘤細(xì)胞以及免疫細(xì)胞的影響。
　　方法:
　　1.構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)miR-21的4T1細(xì)胞株利用慢病毒載體構(gòu)建高表達(dá)miR-21的4T1細(xì)胞株即miR-21-4T1細(xì)胞株，通過實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證該穩(wěn)轉(zhuǎn)株中miR-21的過表達(dá)，熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測miR-21-4T1細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)情況。同時(shí)

3、構(gòu)建空載體對照scramble-4T1細(xì)胞。
　　2.miR-21對4T1生物性狀的影響通過細(xì)胞增殖活力實(shí)驗(yàn)（MTS方法）、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分別觀察miR-21升高后對4T1細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。
　　3.exosome的制備收集72小時(shí)體外培養(yǎng)miR-21-4T1細(xì)胞的上清，差速離心法分離提取exosome:300×g，10分鐘;2000×g，20分鐘;10000×g，30分鐘;然后將上清超高速

4、100000×g離心120分鐘。最后用磷鎢酸負(fù)染exosome并在透射電子顯微鏡下觀察exosome的形態(tài)。
　　4.miR-21-4T1細(xì)胞分泌的exosome功能研究實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測來自miR-21-4T1細(xì)胞的exosome中miR-21的相對表達(dá)情況。MTS實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)分別觀察miR-21-4T1所分泌的exosome對4T1細(xì)胞增殖、遷移能力的影響;采用ELISA試劑盒分析其對小

5、鼠腹腔巨噬細(xì)胞、小鼠骨髓來源的DC細(xì)胞分泌IL-6、IL-10的影響;流式細(xì)胞術(shù)分析其對小鼠骨髓來源的DC細(xì)胞表面分子MHCⅡ、CD86、CD54表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，利用慢病毒載體構(gòu)建的miR-21-4T1細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平升高了2.79±0.5411倍。熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)miR-21-4T1、scramble-4T1細(xì)胞中幾乎均帶有綠色熒光，同樣流式細(xì)胞術(shù)檢測的miR-21-4T

6、1、scramble-4T1細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)率分別能夠達(dá)到93.58％±0.456、77.06％±0.844。
　　2.MTS結(jié)果顯示miR-21-4T1細(xì)胞與4T1細(xì)胞增殖能力沒有顯著性差異，但在劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，miR-21-4T1細(xì)胞遷移能力要高于4T1和scramble-4T1細(xì)胞。
　　3.利用差速離心方法得到的miR-21-4T1細(xì)胞分泌的exosome，通過磷鎢酸負(fù)染在透射電子顯

7、微鏡下觀察到直徑約在40-100nm的橢圓形顆粒，中間淡染，邊緣深染。
　　4.經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測分析后發(fā)現(xiàn)，miR-21-4T1細(xì)胞分泌的exosome中miR-21表達(dá)水平增加了3.49±0.2703倍。
　　5.在增殖實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)中，miR-21-4T1分泌的exosome與對照組沒有明顯的差異。但在Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，它所分泌的exosome能夠促進(jìn)4T1細(xì)胞遷移。
　　6.miR-21-4T

8、1分泌的exosome可以促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-10，但是該功能弱于4T1細(xì)胞的exosome，且這種作用不受TLR7受體阻斷劑所影響。
　　7.miR-21-4T1來源的exosome可以促進(jìn)小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞分泌IL-6、IL-10，減少小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞表面的MHCⅡ分子表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.過表達(dá)的miR-21可以促進(jìn)4T1細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。
　　2.4T1細(xì)胞中的miR-2